RNA抽提详细步骤-

1、RNA抽提指南(TRIZOL法RNA抽提指南(TRIZOL法注意事项:* 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。* 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A 或T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管可能富含RNA酶。* 在TRIZOL 中,RNA 是隔离在RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中

2、烘烤4 小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。抽提步骤:1.匀浆化作用通过离心来沉淀细胞后,弃上清,用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后,将匀浆样品在1530°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。(每510×106的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。2.分离阶段每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15 秒并将其在30°C 下

3、孵育23 分钟。在28°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60%3.RNA的沉淀将水样层转移到一干净的试管中,通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 m lTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在 1530°C 条件下孵育10 分钟并在28°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见,形成

4、一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。(如果希望分离DNA 和蛋白,有机层同样要予以保留。在除去水样层后,样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用。4.RNA的洗脱移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次,每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在28°C 下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5 分钟。5.RNA的再溶解在操作的最后,简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是,不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降

5、低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA,并在5560°C下孵育10 分钟。TRIzol法抽提总RNA组织100mg加1mlTRIzol匀浆(要彻底,后转至EP管(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管颠倒混匀10下,室温5分钟(30°C孵育加氯仿1/5体积(0.2ml(必须按总体积的1/5颠倒混匀15S,室温2-5分钟(30°C孵育4,离心12000g,15分钟转上层水相(约400l于另一1.5mlEP管中加等体积异丙醇(约400 -500l,混匀

6、室温10分钟4,离心12000g,10分钟(30°C孵育弃上清加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配1ml4离心7500g,5分钟弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥溶于DEPC水中至20l(10l-20l(可在55-60水中,<10分钟助溶1:在核酸提取时,为了增加细胞的裂解度,增加核蛋白复合体破碎度,以释放更多的游离核酸,在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在确保没有核酸水解酶存在的前提下,酶反应时间越长越好。2:有时在使用蛋白酶时,为了抑制核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL,并且可将反应温度提高到50-60,并将反应时间缩短到1

7、5-25min,但酶用量必须提高10-20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA,因游离金属离子对酶有抑制。3:许多植物材料中富含酚,在细胞破碎时,在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的锟类物资,影响核酸的提取及降低提取质量,在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体,在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。4:许多生物材料在提取核酸时,都会遇到多糖的污染问题,具体表现为有机溶剂沉淀时,沉淀很多,但复溶时,大量沉淀不溶,电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可

8、采用以下一些办法(1CTAB多次抽提。(2在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度(可到10倍左右,对低浓度样品再进行沉淀。(3在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂,此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积,异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。5:在核酸提取时,酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿,但酚与水有一定的互溶,因此酚抽后,除可能损失部分核酸外,水相中还会残留酚,而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制,因此在操作中可单用氯仿作变

9、性剂、也可用酚/氯仿混合变性,也可用单一酚作变性己,但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。6:在操作中当加入变性剂氯仿后,为了保证核酸样品的完整性,操作要轻,尤其在提DNA 时,更要避免剧烈操作。7:在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2V乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。8:在提取核酸时,如样品浓度低,则应增加有机溶剂沉淀时间,-70下>30min;-20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。9:在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高,而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中,因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保