基因家族分析套路

1、基因家族分析套路（一）近年来，测序价格的下降，导致越来越多的基因组完成了测序，在数据库中形成了大量的可用资源。如何利用这些资源呢？今日我带你生疏一下不测序也能发文章的思路-全基因组基因家族成员鉴定与分析（现在这一领域可是很热奥）；一、基本分析内容n 数据库检索与成员鉴定n 进化树构建n 保守domain和motif分析.n 基因结构分析.n 转录组或荧光定量表达分析.二、数据库检索与成员鉴定1、数据库检索1）首先了解数据库用法，学会下载你要分析物种的基因组相关数据。一般也就是下面这些数据库了n Brachypodiumdb:/n TAIR:h

2、ttp://n Rice Genome Annotation Project ：/.n Phytozome:n Ensemble:/genome_browser/index.html n NCBI基因组数据库：/assembly/?term=2）已鉴定的家族成员猎取。      如何获得其他物种已发表某个基

3、因家族的全部成员呢，最简洁的就是下载该物种蛋白序列文件（可以从上述数据库中下载），然后依据文章中的ID，找到对应成员。对于没有全基因组鉴定的，可以下列数据库中找：   a. NCBI: nucleotide and protein db.     b. EBI: http:/www.ebi.ac.uk/.     c. UniProtKB:/un

4、iprot/2、比对工具。一般使用blast和hmmer，具体使用命令如下：n Local BLASTformatdbi db.fasp F/T；blastallp blastp(orelse) i known.fasd db.fasm 8 b 2(or else) e 1e-5 o alignresult.txt.-b:output two different members in subjec

5、t sequences (db).n Hmmer (hidden Markov Model) search. Thesame as PSI-BLAST in function. It has a higher sensitivity, but the speed islower.Command:hmmbuild-informatafaknown.hmmalignknown.fa; 

6、60;hmmsearchknown.hmmdb.fas>align.out.3、过滤。n Identity: 至少50%.n Cover region: 也要超过50%或者蛋白结构域的长度.n domain: 必需要有完整的该蛋白家族的。工具pfamdb (http:/pfam.sanger.ac.uk/) 和NCBI Batch CD- search. (/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi).n EST 

7、支持n  Blast and Hmmer同时检测到4、通过上述操作获得某家族的全部成员基因家族分析套路（二）本次主要讲解在基因家族分析类文章中，进化部分分析的内容。主要是进化树的构建与分析。一、构建进化树的基本步骤、多序列比对. Muscle program.、Model 选择. 分别针对蛋白序列和核酸序列的模型选择程序。ProtTest program for protein and ModelTest or Jmodetlest for

8、60;DNA(、算法选择。三种. NJ, ML and BI.、软件选择。 MEGA (bootstrap least 1000 replicates), phyML and Mrbayes (、进化树修饰. MEGA: view->options and subtree-> draw options. Also can be decorated 

9、;in word (二、具体步骤 2.1 多序列比对。一般接受muscle。由于 MUSCLE is one of the best-performing multiple alignment programs according to published benchmark tests, with accuracy and speed that are&#

10、160;consistently better than CLUSTALW.2.2 模型选择。对于用蛋白序列构建进化树的可以接受下面命令：   java  -Xmx250m  -classpath  path/ProtTest.jar  prottest.ProtTest  -i alignmfile.phy.运行结果如下图 留意：1）“.Phy” format. Only a

11、llow ten charaters.留意名字不能重复相同。2）AIC: Akaike Information Criterion framework.3）Gamma distribution parameter (G): gamma shape.3）proportion of invariable sites: I. 2.3 构建进化树2.3.1 意义：a聚类分析。如亚家族分类。像MAPKKK基因家族通过进化树可以清楚分为&

12、#160;MEKK, Raf and ZIK三个亚家族.b亲缘关系鉴定。在进化树上位于同一支的往往示意这亲缘关系很近c 基因家族复制分析。争辩基因家族复制大事（duplication events），两种复制大事类型常接受的标准：Tandem duplication: Identity and cover region more than 70% and tightly linked (Holub, 2001).&#

13、160;Chromosomal segment duplication: Plant Genome Duplication Database (PGDD: /duplication/)2.3.2 进化树。一般ML树比较精确，但应结合方法，如NJ树，相互验证。2.3.3 进化部分分析：KaKs计算 简洁的方法. 可以使用下面的网页PAL2NAL(http:/www.bork.embl.de/pal2nal/)2.

14、3.3.2 标准方法：.a. ParaAT: ParaAT.pl-h test.homologs -n test.cds -a test.pep -p proc f axt k -o outputb. KaKs_Calculator m NG(or else) -i test.axt -o test.axt.kaksc.分歧时间计算：Divergenttime（T）&

15、#160;calculation.    T=Ks/2.  : mean 5.1-7.1×10-9  .d. Ka/Ks意义：  Ka/Ks=1.中性进化。.  Ka/Ks<> Ka/Ks>1.正选择。Positively selected genes and produce fitness advantagemutations to evolve 

16、new functions.基因家族分析套路（三）本节主要讲基因结构分析套路1、Motif分析 使用软件MEME，命令如下：  meme sample.fa -dna revcomp -nmotifs 10  -mod zoops -minw 6-maxw 50>meme_htmlFormat.html2、基因结构分布图可以使用在线网站GSDS2.0：website:用法如下：结果呈现3、基因结构常见统计信息：自己excel或写程序统计&#

17、160;  a. The number of intron andexon.   b. The splicing intronpattern inculding 0,1,2 phase.   c. The marked region. Forexample kinase domain.   d. sequen

18、ce length.   e. UTR.4、启动子分析。网站：主要做植物的：http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/留意事项：a. IE brower.b. Only one sequence for oncesearch and the length was limited in 1000 bp.c. DNA&

19、#160;sequence origin: 1000 or1500 bp upstream of ATG of one gene.分析结果：基因家族分析套路（四）一、转录组及芯片原始数据下载网站  1、  GEO datesets/profile(/gds ).。用法见下图。GEO数据ID命名规章：GPL->GSE->GSM.GPL: platformGSE:&#

20、160;multiple series.GSM: multiple samples.GDS  GSE. Thedifference concentrated on the data labeled GDS can be analyzed for one geneonline. It is simple and easily.The data in&

21、#160;the sameGPL can be used to  compare inexperiment下面是在线分析转录组数据的用法：2、EBI ArrayExpress(http:/www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) 该数据库下载数据用法如下：3、PLEXdb(/).该数据库下载数据用法如下，留意用户名和密码！4、SRA db(/sra/)5、DRA db（

22、http:/trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/）二、数据处理 拿到原始数据，要进行处理，才能进行后续数据分析。1、芯片数据。原始数据格式“.cel”格式。以AffyMicroarray数据处理为例叙述主要的命令如下：> library(affy); >library(makecdfenv);  >library> barleyGenome = make.cdf.env(“barleyGenome.cdf")>mydata <-

23、60;ReadAffy() #choose “.cel “ file analyzed.>eset <- rma(mydata);>write.exprs(eset,file="mydata.txt")>design <- model.matrix(-1+factor(c(1,1,2,2,3,3) # Createsappropriate design matrix. >colnames(design

24、) <-c("group1", "group2", "group3") # Assigns column names.>fit <- lmFit(eset, design) # Fits a linear model for each gene based onthe given series

25、0;of arrays.>contrast.matrix <- makeContrasts(group2-group1,group3-group2, group3-group1, levels=design) # Creates appropriate contrast matrix toperform all pairwise comparisons.>fit2 <- contrasts.fit(fit,

26、60;contrast.matrix)# Computes estimatedcoefficients and standard errors for a given set of contrasts.>fit2 <- eBayes(fit2) # Computes moderated t-statistics and log-oddsof differential expr

27、ession by empirical Bayes >topTable(fit2, coef=1,adjust="fdr", sort.by="B", number=10) # Generates list of top 10 ('number=10')differentially expressed genes sorted by B-valu

28、es ('sort.by=B') for firstcomparison group.>write.table(topTable(fit2, coef=1,adjust="fdr", sort.by="B", number=500),file="limma_complete.xls", s=F, sep="t") # Exports complete limma statistics table forfirst comparison group.>results <-&