离子交换层析

1、离子交换层析 1、酶分离纯化、酶分离纯化 将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的要将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程。求相适应的有一定纯度的酶产品的过程。 2、酶分离纯化基本步骤、酶分离纯化基本步骤 提取、纯化、结晶或制剂。提取、纯化、结晶或制剂。一、酶的提纯概述一、酶的提纯概述3、酶分离纯化的原则、酶分离纯化的原则 （1）原料来源方便，成本低，酶含量及比活力高，可溶性和稳定性好； （2）了解酶生物合成的基因分子学背景； （3）加工条件尽可能温和，减少破坏天然构象而导致的酶失活； （4）提供有利于酶活保持的最适溶液环境

2、（pH、温度、离子强度、金属离子等）； （5）建立灵敏、特异、精确的检测手段，有效评估纯化过程。 （6）选择恰当的纯化策略（依据酶的性质选用各种纯化技术，如凝胶过滤、离子交换、亲和分离等）。4、酶提取液一般组成、酶提取液一般组成抽提液包含抽提液包含： 离子强度调节剂(常用蔗糖或的KCL) pH缓冲液 温度效应剂（甘油、二甲基亚砜，以防酶分子因热变性） 蛋白酶抑制剂（PMSF、DIFP） 抗氧剂（DTT、巯基乙醇） 重金属络合剂（EDTA、柠檬酸） 增溶剂（TritonX-100，抽提生物膜中的酶时需加此类除垢剂）5、酶的提纯标准及剂型、酶的提纯标准及剂型 （1 1）酶的纯度标准）酶的纯度标准

3、工业级、食品级、层析纯、电泳纯 （2 2）酶制剂的剂型）酶制剂的剂型 液体酶制剂：除菌、渣后纯化直接制成或加以浓缩。 工业级固体酶制剂：纯度不一定要求严格，但要符合安全卫生要求。直接浓缩干燥制成；或发酵液滤去菌后喷雾干燥制成；或加淀粉等填充物。 高纯度固体纯酶制剂：较高的纯度要求，常作为分析试剂或用作医疗药物。步骤步骤体积体积（ml）蛋白浓度蛋白浓度mg/ml）蛋白总量蛋白总量（mg）酶浓度酶浓度(u/ml)比活力比活力（u/mg）总活力总活力（u）产率产率（%）提纯倍数提纯倍数粗无细胞抽提液粗无细胞抽提液1000121200050.41650001001.0050热变性除杂热变性除杂蛋白蛋白

4、1000880004.80.604800961.44硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀部分部分250375011.03.672730558.83DETE-凝胶层析凝胶层析pH梯度梯度（第（第50-60管）管）259225839.822004423.6离子交换层析离子交换层析KCL梯度梯度洗脱（洗脱（21-31管）管）573536452182036.4125凝胶过滤葡聚糖凝胶过滤葡聚糖G-100（第（第31-40管）合并管）合并100.929.2170185170034444 6、酶提纯过程特征、酶提纯过程特征（设想提纯步骤）氯过氧化物酶提取纯化过程记录步骤总体积ml蛋白质浓度mg/ml蛋白质总量mg

5、酶浓度比活力总活力产率提纯倍数U/mlU/mgU%发酵液10001.3461346185.54137.85 1855401001发酵液脱色9851.2741255 196.63154.34 193680.55104.39 1.12 膜浓缩1506.282942 931.43148.27 139714.575.30 1.08 硫酸铵盐析326.76216 3565.47527.44 114095.0461.49 3.83 双水相萃取5.84.5727 13589.722973.68 78820.37642.48 21.57 DEAE-53纤维素离子交换层析5.24.4123 14504.4132

6、88.98 75422.93240.65 23.86 Sephadex G-75凝胶层析6.92.9720 101503417.51 7003537.75 24.79 二、酶的提取二、酶的提取 固体材料 液体材料 干燥粉碎粗酶制品 浸提液浸泡 提取 浓缩酶液真空浓缩- 酶液添加稳定剂、防腐剂稀酶液 加填充剂 盐析（硫酸铵等） 干燥 沉淀酶 粗酶粉 成型干燥酶粉或酶粒 一般工业级酶制剂提取工艺流程图三、酶纯化三、酶纯化 酶纯化方法的选择： 一般依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一性等性质而建立。常用的提纯方法：常用的提纯方法： 离子交换层析、色谱聚焦、电泳、等电聚焦、盐溶、盐析、离心分

7、离、透析超滤、凝胶过滤、亲和层析、染料配体亲和层析、免疫吸附层析 四、分离纯化要点四、分离纯化要点1 1、材料选择、材料选择 （1）确定材料选择标准（产地、种类、年龄或季节、健康状态等）； （2）材料的预处理条件确定（取舍、保藏、保鲜等）； （3）提取液的选择。2 2、固液（细胞）分离、固液（细胞）分离（1）板框过滤 板框过滤原理板框过滤原理料液流滤液流（2）离心机分离3、细胞的破碎、细胞的破碎 （1 1）机械破碎法）机械破碎法 机械捣碎法： 高速捣碎机（10000r/m），常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞破碎。在实验室中常用； 匀浆法： 适用于细菌、真菌的破碎，且容量大（几升）。

8、不锈钢、玻璃或Teflon匀浆器。 （2）物理破碎法）物理破碎法 温度差破碎法（冻融法）： 一般在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF（苯甲基磺酰氟）、络合剂EDTA、还原剂DTT（二硫苏糖醇）以防破坏目的酶。 压力差破碎法： 高压冲击、突然降压、渗透压差等方法。 超声波破碎法： 频率20kHz，空穴作用使细胞模破碎。（3 3）化学破碎法）化学破碎法 有机溶剂处理： 常用甲苯、丙酮、氯仿等。 表面活性剂处理： 常用Triton、Tween等。(4）酶学破碎法）酶学破碎法 外加酶处理： 如溶菌酶、B-葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶等。 自溶法： 4、酶的提取、酶的提取 （1 1）吸附）吸附 物理吸

9、附： 通过分子力作用，性质稳定、吸附快、选择性差； 化学吸附： 通过化学键作用，单分子层吸附，吸附慢、选择性强； 交换吸附： 通过带电荷离子作用，吸附能力与电荷及离子半径有关。 （2）沉淀）沉淀 盐析法： 常用盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾等； 等电点法： 有机溶剂法： 非离子型聚合物沉淀法（絮凝） 高价金属离子沉淀法（凝聚） （3 3）离子交换法）离子交换法： 提取液中的酶吸附或扩散到树脂表面相互置换离子而进行的提取过程。 离子交换剂分类离子交换剂分类：阳离子交换剂、阴离子交换剂、两性离子交换剂、吸附性交换剂、选择性交换剂、氧化还原交换剂。 离子交换剂结构离子交换剂结构：不溶性网状骨架、官能

10、团和带电荷离子。RSO3H RSO3-+H+RSO3-+B+ RSO3BRSO3B +Na+ RSO3Na+BRSO3Na+H+ RSO3H离子树脂交换剂离子树脂交换剂 离子交换树脂的处理离子交换树脂的处理： 干树脂充分吸水膨胀（12h）-2mol/lNaCL，4h水洗2mol/lHCL或NaOH,4h洗至所需的pH； RSO3H RSO3-+H+（使用状态） RSO3-+B+ RSO3B（交换状态） RSO3B +Na+ RSO3Na+B（洗脱状态） RSO3Na+H+ RSO3H（再生状态） 上柱交换：采用顺流式（正上柱）或逆流式（倒上柱）两种。已交换层交换带未交换层A：活性离子；：活性离

11、子； B：被交换离子：被交换离子A为0，B饱和浓度CsA饱和浓度Cs 渐小，B渐趋0A为Cs ，B饱和浓度0BBBBBBBBBBAAAAABBBBB交换层未交换层交换层至B漏出点，停止交换，进行洗脱或再生洗脱：洗脱： 用亲和力更强的同性离子取代被吸附的目的产物。常用钠离子或氨离子等。 再生：HCL或NaOH处理数小时。（转型Na+或H+） 如：钠型强酸树脂用NaOH溶液再生； 氢型强酸树脂用HCL再生。水洗至中性保存。（4 4） 过滤分离过滤分离 粗滤粗滤: 借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2的大颗粒。 主要用于分离：酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣以及其它大颗粒。 介质介质： 滤纸、滤布

12、、玻璃纤维、陶瓷、滤板等。为了加快过滤速度，提高分离效果，经常要添加助滤剂，如：硅藻士、活性炭、纸粕等。 常压过滤常压过滤：以液位差为推动力。速度慢，分离效果差。 加压过滤加压过滤：以压力泵或压缩空气为推动力。 减压过滤减压过滤：又称真空过滤或抽滤。 （5）膜分离技术膜分离技术 微滤微滤：截留颗粒直径。主要用于分离细菌、灰尘等。介质：微孔陶瓷滤筒。操作压力：以下。 超滤超滤：截留颗粒直径20-2000埃，相当于分子量1000500000道尔顿。主要用于分离病毒和大分子物质等。介质：丙烯腈、醋酸纤维素、尼龙等高分子聚合物制成的多孔薄膜。操作压力：以下。 反渗透反渗透：孔径小于20埃。截留颗粒分子

13、量小于1000道尔顿。主要用于分离各种离子和小分子物质等。5 5、酶的纯化、酶的纯化（1）层析）层析 吸附层析吸附层析： 常用吸附剂：硅藻土、氧化铝、活性炭等。一般在低pH、低离子强度下对酶有吸附作用，在高pH、离子强度下对酶有解吸附作用。 离子交换层析离子交换层析： 利用可解离基团对各种离子的亲和力不同而分离。母体：离子交换树脂、离子交换纤维素（DEAE纤维素、AE-纤维素、CMC）和离子交换凝胶（DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶DEAE琼脂糖凝胶、CM凝胶等）。凝胶层析凝胶层析：又称排阻层析或分子筛方法，是根据蛋白质的大小和形状进行分离和纯化的。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状

14、结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质。如：葡聚糖凝胶sephadexG-10-200、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、CM凝胶等）。 亲和层析亲和层析：配基连接在不溶性母体（葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、CMC凝胶等）上母体和配基之间常引入连接臂。母体与配基相联称母体活化。 母体母体连接臂配基配基分离物质分离物质（2 2）电泳分离）电泳分离A、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 垂直板电泳装置垂直板电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳

15、凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所

16、以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。 相对迁移率相对迁移率 利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个个pHpH梯度。梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的每种蛋白质都将迁移至与它的pI pI 相一致的相一致的pHpH处。处。凝胶中加有两凝胶中加有两性电解质溶液性电解质溶液（pH9-3） 加电场后在加电场后在凝胶内形成一凝胶内形成一个稳定个稳定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明样凝胶染色表明样品按照各自品按照各自pI值值沿着沿着pH梯度分布梯度分布B

17、 、等电聚焦电泳（、等电聚焦电泳（ IFE）等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）高高pH高高pH低低pH低低pH（3 3）结晶结晶 盐析结晶法： 有机溶剂结晶法 透析平衡结晶法 等电点结晶法浓缩浓缩：真空蒸发和薄膜蒸发。（4 4）浓缩与干燥）浓缩与干燥干燥：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥实例: CPOCPO的提取纯化的提取纯化（实验方案） 1、CPO提取纯化过程 固液分离-除杂处理-盐析沉淀-脱盐-层析纯化-浓缩-冷冻干燥-成品 2 2、分离、分离 发酵液3000 g冷冻离心分离10min，得清液。

18、加4-7%PEG，搅拌30min，脱色处理； 3000 g冷冻离心分离10min，得脱色清液。 调节脱色清液pH至； 阴离子交换树脂除杂蛋白。（处理量待定）提取提取 硫酸铵盐析：根据分离液体积，计算硫酸铵加入量，搅拌并缓慢添加固体硫酸铵至100%硫酸铵饱和度，沉淀CPO。 4静置沉淀1-4h. 4，12000r/min离心分离CPO蛋白沉淀物。 缓冲液溶解沉淀物（控制体积数尽可能小） 溶解的CPO溶液装入透析袋，加缓冲液透析至无硫酸根离子。 浓缩酶液：在试验量不大情况下，可采用将透析袋埋入PEG中，将水份吸出。纯化纯化（1）DE-53预处理称DE-53 5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去

19、上层细粒。按每克DE-53加0.5N NaOH 15ml的比例，将DE-53浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。处理完后，将DE-53浸泡于，PH 5.8 PB中过夜。(2)(2)装柱装柱(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 (2)将，pH5.8 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的DE-53。待DE-53凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋夹，控制流

20、速1ml/分钟，同时连续倒入糊状DE-53凝胶至所需高度。(3)关闭出水口，待DE-53凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 （4）平衡:启开出水口螺旋夹，控制流速12-14滴/分钟，使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。达到一致时关闭出水口，停止平衡。（5）加样及洗脱:启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应床体积的2，蛋白浓度以100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数ml洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速1214滴分钟。 （6）收集：开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集35ml。共收集1015管。 （7）测蛋白：以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm，与OD260nm，按前述公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。 （8）合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，于4保存备用。 （9）DE-53的再生:在柱上先