电子克隆（课堂PPT）

1、.1电子克隆简介电子克隆简介南京农业大学生命科学学院南京农业大学生命科学学院沈文飙沈文飙.2n什么是电子克隆什么是电子克隆n拼图游戏一样的原理拼图游戏一样的原理 n应用应用 n如何做拼图游戏如何做拼图游戏n常用软件及网络资源简介常用软件及网络资源简介 n优点与缺点的讨论优点与缺点的讨论 n现状与展望现状与展望 .3什么是电子克隆什么是电子克隆nWatson & Crick 成功解析了成功解析了DNA分子分子二级结构，开创了二级结构，开创了分子生物学时代分子生物学时代nKarry Mullis 发明了发明了PCR反应，体外反应，体外大大规模规模、有目的有目的和和快速地快速地克隆目标基因成

2、克隆目标基因成为可能为可能 n信息科学技术特别是数据库技术在战后信息科学技术特别是数据库技术在战后飞速发展飞速发展.4什么是电子克隆什么是电子克隆n表达序列标签表达序列标签（expressed sequence tags，EST）是对某个基因）是对某个基因cDNA克隆测序所得的部克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为分序列片段，长度大约为200600bp n由于基因由于基因表达调控作用表达调控作用不同，同一个基因的不同，同一个基因的mRNA剪接位点和方式剪接位点和方式不同，所以同一个基不同，所以同一个基因的全长因的全长cDNA可能包含多个可能包含多个ESTnEST既代表了基因既代表了基因cDN

3、A的某一区段，也表征的某一区段，也表征了成熟了成熟mRNA可能的剪接方式可能的剪接方式.5什么是电子克隆什么是电子克隆n电子克隆技术是生物学数据库中电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域性序列比对和归类分析、重叠区域组装组装和和拼拼接接等方法延长等方法延长EST序列，直至没有与之同源序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的为是相对应基因的全长全长cDNA，根据所得的，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读

4、框两端的引物，序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行进行RT-PCR克隆出相应基因的方法克隆出相应基因的方法 .6什么是电子克隆什么是电子克隆n传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增扩增cDNA末端或构建末端或构建cDNA文库并采用原位文库并采用原位杂交进行筛选，杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低本高、得率低；运用电子克隆的方法延伸得；运用电子克隆的方法延伸得到的到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通序列，无论表达转录如何调控，都能通过过

5、PCR扩增出表达的那一段基因扩增出表达的那一段基因n传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼.7拼图游戏一样的原理拼图游戏一样的原理 n相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的种中的同源基因同源基因序列在一定程度上可以代表序列在一定程度上可以代表目的基因的序列目的基因的序列n可代表程度与两序列的相似度直接相关，加可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的可行的 ，但需要作，但需要作同源性检验同源性检验以克服主观因以克服主观因素的影响素的

6、影响.8拼图游戏一样的原理拼图游戏一样的原理n借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。的微调。n剩下的工作就是对拼接出的剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的进行可能的开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引物，端的引物，RT-PCR扩增侯选基因扩增侯选基因.9应用应用n电子克隆主要应用于两个方面：电子克隆主要应用于两个方面：n一个是利用一个是利用EST序列检索同源性序列，并由序列检索同源性序列，并由此拼接此拼接cDNA序列以

7、期挖掘新基因序列以期挖掘新基因n另一方面是在全基因组已经测序的物种中，另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因现的基因n目前应用比较广泛的是第一方面目前应用比较广泛的是第一方面 .10应用应用n数据库查询数据库查询n数据库比对数据库比对n文件下载文件下载n序列分析序列分析n序列装配序列装配n分子模型分子模型n结构分析结构分析n功能分析功能分析.11应用应用n在全基因组已经测序的物种中推测新基因的在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤如下：步骤如下：n分析和定位开放阅读框分析和定位开放阅读框 n虚拟翻译并对多肽

8、链序列检索比对虚拟翻译并对多肽链序列检索比对 n可靠性检查可靠性检查 n分析与之相关的调控序列分析与之相关的调控序列 .12如何做拼图游戏如何做拼图游戏n以电子克隆新的水稻以电子克隆新的水稻过氧化氢酶过氧化氢酶（catalase，CAT）基因为例，简介延伸）基因为例，简介延伸cDNA的流程：的流程：n以登录号为以登录号为CA759712的的EST在对其在核酸序在对其在核酸序列数据库中进行列数据库中进行BLAST检索比对时，发现登检索比对时，发现登录号为录号为CB652681的序列推测为水稻的序列推测为水稻CAT基因基因的部分序列，与信息标签的部分序列，与信息标签 EST具有比较高的具有比较高的

9、同源性，该同源性，该EST序列将作为种子序列序列将作为种子序列 .13如何做拼图游戏如何做拼图游戏n将检索得到的同源序列保存到将检索得到的同源序列保存到PC机上，运行机上，运行DNAStar软件包，将上述序列输入，由于基软件包，将上述序列输入，由于基因测序是借助质粒载体完成的，序列中难免因测序是借助质粒载体完成的，序列中难免混有载体序列，因此需要运行程序查找载体混有载体序列，因此需要运行程序查找载体序列，对序列进行末段序列，对序列进行末段修剪修剪去掉冗余部分去掉冗余部分 .14如何做拼图游戏如何做拼图游戏n程序根据外显子和内含子的编码规则和排布程序根据外显子和内含子的编码规则和排布方式搜索和方

10、式搜索和定位开放阅读框定位开放阅读框，开放阅读框是，开放阅读框是电子克隆的重点研究对象；接着，程序对各电子克隆的重点研究对象；接着，程序对各段序列的重复序列和差异序列进行逐一检索段序列的重复序列和差异序列进行逐一检索和比对，并对重叠区域进行和比对，并对重叠区域进行拼接和组装拼接和组装，构，构建重叠序列群建重叠序列群n以上各步骤由程序自动完成.15如何做拼图游戏如何做拼图游戏n以构建的重叠序列群为信息标签，进一以构建的重叠序列群为信息标签，进一步检索比对，搜索其高度同源序列步检索比对，搜索其高度同源序列n如果发现了与之高度同源的未知序列，则重复上述步骤；若没有新的发现，说明拼接组装得到的EST可

11、能囊括了所以可能的目的基因序列 n根据以上步骤，得到了一个全长为根据以上步骤，得到了一个全长为1678 bp的的EST序列序列 .16如何做拼图游戏如何做拼图游戏n以此以此EST序列为序列为cDNA序列，对其设计囊括整序列，对其设计囊括整个开放阅读框的特异性引物，设计得到的上个开放阅读框的特异性引物，设计得到的上游引物为：游引物为：5-CTA-GCC-CAC-TAC-CAT-GGA-TCC-TTG-3，下游引物为：，下游引物为：5-CAG-AAT-TTC-TGT-AGC-CTT-GCT-GAT-3， n引物的具体合成可交由经营分子生物学相关产业的公司商业化合成 .17如何做拼图游戏如何做拼图游

12、戏n对延伸出的对延伸出的cDNA其作其作人工人工的可靠性验证的可靠性验证 n提取水稻中总提取水稻中总RNA，进行，进行RT-PCR，电泳检，电泳检测结果测结果 n转录调控的研究转录调控的研究 .18常用软件及网络资源简介常用软件及网络资源简介 nDNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，是一款电子克隆中常用的软件包，它以功能全面和强大而著称，它主要包括以它以功能全面和强大而著称，它主要包括以下几个应用程序：下几个应用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和、和SeqMan II .19常用软件及网

13、络资源简介常用软件及网络资源简介nEditSeq是输入并且修剪是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的或蛋白质序列的工具。工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也能读取大部分的序列格式，也可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复制、粘贴得到。序列被打开后，制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使能使用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻译、寻找开放读框以及进行阅读校对译、寻找开放读框以及进行阅读校对 .20常用软件及网络资源简介常用软件及网络资源简介nGeneQuest可以发现注释可以发现注释DNA序列中的基因，序

14、列中的基因，并提供相关的参数，包括并提供相关的参数，包括ORF、拼接位点、拼接位点、转录因子结合位点、重复序列、限制性内切转录因子结合位点、重复序列、限制性内切酶酶切位点等。通过应用酶酶切位点等。通过应用“methods”命令，命令，序列的各项相关信息和参数可以以图形的形序列的各项相关信息和参数可以以图形的形式展示出来。式展示出来。.21常用软件及网络资源简介常用软件及网络资源简介nMapDraw可以制作简单的线性图到有注释的可以制作简单的线性图到有注释的环形图，在展示限制性酶切位点的同时，还环形图，在展示限制性酶切位点的同时，还可以同时展示序列的可以同时展示序列的feature、开放阅读框及

15、、开放阅读框及其翻译结果。其翻译结果。MapDraw工具主要应用与规划工具主要应用与规划酶切位点和克隆实验，产生详细和充分的结酶切位点和克隆实验，产生详细和充分的结果概括果概括 .22常用软件及网络资源简介常用软件及网络资源简介nMegAlign提供了比对方法，进行提供了比对方法，进行DNA和蛋白和蛋白质序列的配对和多序列比较。多序列比对可质序列的配对和多序列比较。多序列比对可以在以在MegAlign的工作界面中进行查看和编辑。的工作界面中进行查看和编辑。可以根据队列的结果制作进化树，有关序列可以根据队列的结果制作进化树，有关序列距离的数据和残基替代可以作成表格距离的数据和残基替代可以作成表格

16、.23常用软件及网络资源简介常用软件及网络资源简介nPrimerSelect能够辅助设计引物和探针。输入能够辅助设计引物和探针。输入DNA、RNA 或反向翻译的蛋白质模板序列后，或反向翻译的蛋白质模板序列后，PrimerSelect可以在计算序列的各种参数，用可以在计算序列的各种参数，用户可以通过控制各种参数限定计算结果。在户可以通过控制各种参数限定计算结果。在模板处理后，模板处理后，PrimerSelect按照用户定义的参按照用户定义的参数确定引物的位置，并给引物评分，然后筛数确定引物的位置，并给引物评分，然后筛选出模板序列上的最佳引物序列。选出模板序列上的最佳引物序列。.24常用软件及网络

17、资源简介常用软件及网络资源简介n美国国家生物信息中心（美国国家生物信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI），），/ n美国冷泉港实验室（美国冷泉港实验室（Cold Spring Habor Laboratory，CSHL），），/ n欧洲分子生物学信息网（欧洲分子生物学信息网（European Molecular Biology Net，EMBnet），），/ .25常用软件及网络资源简介常用软件

18、及网络资源简介n欧洲分子生物学实验室（欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL），），http:/www.embl-heidelberg.de/ n日本国立遗传研究所（日本国立遗传研究所（National Institute of Genetics，NIG），），http:/www.ddbj.nig.ac.jp/ n北京大学生物信息学中心（北京大学生物信息学中心（Peking University Center of Bioinformatics，PKUCBI），），http:/ .26优点与缺点的讨论优点与缺点的讨论n与传统的

19、基因克隆方法相比，电子克隆有以与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以下的优点：下的优点：n简便快速，成本低廉，设备简单简便快速，成本低廉，设备简单 n对操作人员技术要求不高对操作人员技术要求不高n成功率高成功率高 .27优点与缺点的讨论优点与缺点的讨论n尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然而在实际操作中依然存在些不足之处：而在实际操作中依然存在些不足之处：n电子克隆得到的电子克隆得到的cDNA序列是由计算机虚拟出序列是由计算机虚拟出来的，来的，现实中可能并不存在现实中可能并不存在n研究人员不可完全迷信软件提供的结果，最研究人员不可完全迷信软件提供的结果，最好对分析做好对分析做人工人工可靠性验证可靠性验