浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

1、浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究                作者：陆丽君，孟锐锋，国强，朱珊丽，张丽芳【摘要】  目的：制备高效价EB病毒膜蛋白抗体，并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法：将B95-8细胞培养至3×105/mL时，超声破碎，纯化获得EB病毒膜蛋白抗原；EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化，在家兔背部皮下多点免疫注射，间隔2周免疫，共3次，并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清，检测兔免疫血清抗

2、体IgG；进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性，同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果 ：所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体，最高滴度达1:6 400。结论 ：用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔，可成功制备高效价的特异性血清抗体，为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。 【关键词】  EBV；抗体；免疫性   Abstract:  Objective: To prepare high-titer rabbit serum antibody against

3、 EBV membrane protein. Methods: B95-8(EBV) cells were cultivated and proliferated in cell culture system with RPMI-1640 culture medium (with 10% FBS and Pen/Strep). Thereafter，the purified B95-8(EBV) was harvested using supercentrifuge method. Prepare EBV membrane protein containing Freund adjuvant

4、by routine method. Four rabbits were immunized with the prepared antigen by subcutaneous injection at various sites of skin on back for every two weeks，three times in all. The sera of these immunized rabbits were collected separately for preparation of the rabbit serum IgG. Specific binding of the r

5、abbit serum antibody and the EBV membrane protein were analyzed by Western blot and the titer was assayed by ELISA. Results: All of the immunized rabbits produced high-titer serum antibody after the second booster. The highest titer of antibody against EBV membrane protein was 1:6 400. The result of

6、 Western blot showed the rabbit serum antibody could bind to the EBV membrane protein specifically. Conclusion: The specific rabbit serum antibody against EBV membrane antigen，with high titer，is successfully prepared. It laid a foundation of development of immunology method for detection of EBV memb

7、rane antigen.   Key words:  EBV；antibody；immunity   EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一含有包膜的DNA病毒，在人群中感染非常普遍，与某些肿瘤的发生和发展密切相关1，如Burkitts淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病和成人T细胞淋巴瘤等，其中鼻咽癌在东南亚及我国南方地区高发；研究发现，EBV感染尚与胃癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤的发病有一定的相关性2-3。EBV在感染机体时，可在宿主细胞膜上表达包膜糖蛋白及潜伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP）等膜蛋白，

8、可诱导机体产生特异性的免疫反应。因此，EBV膜蛋白是EBV病毒检测及其疫苗制备研究的靶抗原，是目前EBV研究的前沿热点之一。为获得高效价的EBV膜蛋白抗体，本研究利用B95-8细胞制备EBV膜抗原，通过免疫家兔制备特异性免疫血清，并对其效价和与EBV结合的特异性进行了鉴定。    1  材料和方法   1.1  材料   1.2  方法    2  结果   2.1  B95-8细胞培养  B95-8细胞为悬浮细胞，

9、镜下观察细胞数目多，形成多个细胞岛，形态规则，折光性好，表明生长状态良好，见图1。   2.2  EB病毒膜蛋白血清抗体效价检测结果  4只家兔免疫血清经1:50直至1:6 400稀释度倍比稀释，各稀释度血清于490 nm波长处读取吸光度值，见表1。按照公式：待测标本A值-空白对照A值/(阴性对照A值-空白对照A值)2.1为阳性，阳性血清的最高稀释度即为该血清的效价。结果，4只家兔在全程免疫后均产生了血清特异性抗体。   2.3  EB病毒膜蛋白血清抗体产生趋势分析结果   4只家兔血清特异性抗体在0、1

10、、3、5周产生趋势，见图2。于免疫后约1周，4 只家兔均开始产生血清特异性抗体，并于第5周达到最大值。4只家兔之间血清特异性抗体效价比较差异无显着性（P0.05）。   2.4  EBV血清抗体特异性检测结果  兔免疫血清分别按1:50、1:100 和1:200稀释后，用Western Blot检测其与EBV膜蛋白结合的特异性。结果如图3示，血清稀释到1:100时硝酸纤维膜上出现清晰的3条特异性条带，分子质量大小分别约为54 kD、39 kD和18 kD。而培养基对照孔则无。   3  讨论   目前，制

11、备抗体常用的方法有免疫动物或杂交瘤细胞技术等。利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具备纯度高、特异性强等优点，在临床诊断、治疗和实验研究中应用广泛，但是单克隆抗体仍然存在仅针对单个抗原表位的局限性，同时制备技术要求高，成本昂贵。而利用免疫动物制备的免疫血清多克隆抗体具有制备简单、成本低、来源方便等优点，且可同时针对多个抗原表位从而提高检测的敏感性，因此在免疫学检测和诊断实验技术中仍然应用广泛。   Tsuge等从传染性单核细胞增多症患者体内分离的B细胞中提取EBV，进而感染非洲绒猴B淋巴细胞，建立了EBV转化的细胞系，即B95-8细胞。B95-8细胞为一悬浮细胞，其培养上清中含有

12、释放出的EB病毒完整颗粒，而细胞膜上却表达各种EB病毒的蛋白，包括包膜糖蛋白和仅在潜伏感染时表达的LMP。LMP有LMP1和LMP2两种类型，前者是目前唯一被证实能促进细胞转化甚至恶变的重要物质，其引起的免疫反应较弱；后者本身不是转化蛋白，但在EB病毒感染的患者体内可持续表达，并可诱导机体产生有效的保护性免疫应答。因此，LMP2成为EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原，用于EB病毒感染相关疾病的免疫机制、疫苗设计及其免疫效应等研究。   根据B95-8细胞的特点，各家实验室均有报道利用其制备EBV及EBV膜蛋白进行研究。Dolken等10用B95-8细胞制备的蛋白，通过固相放射免

13、疫测定法，证实用B95-8细胞可成功制备EBV膜蛋白，并且其膜蛋白复合物至少存在两个亚型。Sairenji等11用B95-8制备了EBV膜蛋白，发现可被EB病毒糖蛋白包膜抗原gp350/220的3种单克隆抗体所识别。本研究经Western blot检测，发现用B95-8细胞制备的EBV膜蛋白可出现3条特异性条带，其中分子量约54 kD和39 kD的条带分别与已知的LMP2A（54 kD）和LMP2B（40 kD）的分子量相一致。            采用B95-8细胞作为EB病毒膜蛋白抗原，通

14、过免疫家兔制备EBV病毒膜蛋白免疫血清，经PubMed检索未见有类似的报道。本研究获得的EBV膜蛋白兔免疫血清，可进一步应用于EBV感染及其相关肿瘤性疾病的检测，如可通过免疫荧光或免疫组化等方法检测组织细胞表达的EBV膜蛋白抗原，可进行定位诊断EBV感染等，为EBV感染的免疫机制研究及临床EB病毒感染的检测打下了基础。【参考文献】  1 Sample J, Liebowitz D, Kieff E. Two related Epstein-Barrvirus membrane proteins are encoded by separate genes J. JVirol, 1989

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16、 therapeutics J. Front Biosci, 2006,11(2):2672-2713.Lin JC, Raab-Traub N. Two strains of Epstein-Barr virus (B95-8 and a P3HR-1 subclone) that lack defective genomes induceearly antigen and cause abortive infection of Raji cells J. JVirol, 1987, 61(6):1985-1991.Fox RI, Pearson G, Vaughan JH. Detecti

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