常规植物石蜡制片技术的改进及应用_图文

1、基金项目:成都大学2011年自然科学基金,基金号:2011XJZ24。作者简介:王静(1981,女,四川冕宁人,博士,讲师,主要从事植物学与环境的教学和科研工作。收稿日期:20110509常规植物石蜡制片技术的改进及应用王静1左幸2黄正文1(1成都大学城乡建设学院,四川成都610106;2二滩水电开发有限责任公司,四川成都610051摘要:石蜡切片技术在植物科学技术研究领域扮演着十分重要的角色,并为植物组织结构的研究做出了巨大贡献,现代植物分子生物学研究中仍需石蜡切片技术支持。以凹叶木兰的雌、雄蕊群及花被片作为实验材料,通过改良脱水、包埋、染色、分色等制片环节,设计了一种优良、易操作的植物组织

2、石蜡制片方法,并对实验操作中常见的问题和注意事项进行了讨论。实验结果表明该方法简化了实验步骤,节约了实验药品,减少了实验中有毒试剂的使用和接触,提高了制片质量并使同一批制片染色效果统一。关键词:植物组织学;石蜡切片;改进和应用中图分类号Q94文献标识码A文章编号10077731(2011113604Improvement and Application of Plant Paraffin SectioningWang Jing 1(1College of Urban and Rual Construction ,Chengdu University ,Chengdu 610106,China

3、Abstract :Paraffin Sectioning not only plays an important role in plant science research ,but also make a tremendous contri-bution to studying composition and structure of plantModern plant molecular biology still needs the techniqueThis study used the gynoecium ,androecium ,tepals of Magnolia sarge

4、ntiana as experimental material ,improved traditional paraffin sec-tioning ,such as dehydration ,embedding ,stain ,separationWe discussed typital problems and caution items in the im-proved Paraffin SectioningThe experimental results that the new technique simplified the process of paraffin sectioni

5、ng ,saved experiment cost ,reduced touching toxic reagent ,obtained quality slidesKey words :Plant histology ;Paraffin sectioning ;Improvement amd application近年来,随着新设备的出现,在经典石蜡切片技术的基础上,不断涌现出一些对植物组织结构研究的新技术,如超薄切片、半薄切片、冰冻切片等技术13,但这些方法都是在经典的石蜡切片技术上发展而来的。至今,石蜡切片法仍为制片技术的经典方法,在植物组织学、比较解剖学、分类学、细胞学和发育生物学研究中

6、得到广泛应用。此外,石蜡切片法能与其他新技术结合应用于免疫学、现代植物分子生物学等学科中,如将免疫荧光检测技术与石蜡切片相结合,用于抗原定位4;在用于细孢原位核酸分子杂交技术中,可对材料中被杂交的DNA 分子进行定位、定量分析或观察分析基因表达(mRNA 水平56。该法有容易操作和成本低廉的优点,且标本经石蜡包埋后,可进行连续切片或永久保存。经典的石蜡切片法基本步骤包括样品的采集、固定、脱水(、透明(、浸蜡、包埋、切片、贴片、烘片、脱蜡、复水、染色、脱水(、分色、脱水(、透明(和封片等一系列特殊处理步骤7。由于石蜡材质的性状特点使得经典的石蜡切片法存在较多制片难点。其中,影响实验成败的主要原因

7、包括:(1制片周期长,一般从材料固定到封片至少都要一周以上;(2脱水、透明、浸蜡、包埋的过程中操作不慎易使材料变脆、变硬或变形,从而影响染色;(3手续繁琐,染色前要脱蜡、水化处理,染色后又需脱水、透明;(4脱蜡后的切片在水化和脱水时,植物组织常由于对载玻片的粘附能力降低而脱落,特别是诸如孢子、花粉及胚囊等孤立分散的细胞;(5由于一般染料都极易溶于酒精,故染色后脱水时,切片容易褪色,不易把握分色的度,造成染色单一和片面化。20092010年,在采用石蜡切片法对凹叶木兰(Magnolia sargentiana 的大小孢子发育进行研究期间,针对该法存在的上述问题,通过大量摸索性实验,对传统石蜡切片

8、技术进行了优化和改进,并取得了较好的效果,制出色彩鲜艳、分色恰当、组织结构完整清晰的装片。本文将详细介绍实际操作中的技术流程,以便初学者准确掌握并能制得满足要求的高质量植物石蜡制片。1材料、仪器设备与准备工作1.1材料实验材料为木兰科植物凹叶木兰(Magnolia63安徽农学通报,sargentiana不同发育时期的花蕾,采自四川省雷波县麻咪泽自然保护区及冕宁县冶勒自然保护区。1.2仪器Zeiss Axioskop40光学显微镜、Leica JUNG RM2025切片机、染色架(铜质、鼓风干燥箱、展片台、酒精灯、切片盒等。1.3试剂和准备工作FAA固定液、系列浓度酒精、1%番红水溶液、1%固绿

9、溶液(95%酒精做溶剂、粘片剂(铬矾明胶、二甲苯、石蜡和中性树胶。粘片剂配制方法:5.0g明胶完全溶解于1000mL温热的蒸馏水中,加0.5g铬矾,冷却后过滤,贮存于试剂瓶中。蜡粉:用单面刀片刮取石蜡粉末,备用。粘片时用的载片:用玻棒或滴管取一小滴粘片剂滴在洗净干燥的载片上,均匀涂抹后放入载片盒,放进35鼓风干燥箱烘干、备用。注意:抹有粘片剂的一面朝向同侧摆放,并在切片盒上用标签标注抹有粘片剂的方向,便于后期粘片使用。2方法2.1取材与固定新鲜采集的凹叶木兰花蕾直接放入FAA固定液中固定48h后可长时间保存。将固定好的凹叶木兰花蕾剥去外层苞片和花被片,用解剖刀和镊子取下雄蕊群和雌蕊群。将每朵花

10、上的雌雄蕊群和几块花被片组织(1cm2分别放入50mL广口试剂瓶,贴上标签,倒入适量70%酒精溶液放置2h,洗去FAA固定液并脱水。2.2脱水与透明2h后,将试剂瓶中70%酒精缓缓倒出,然后倒入适量85%乙醇,放置2h后,依次按前述方法将材料经90%乙醇和95%乙醇(每级2 3h、100%乙醇(2次,每次1h逐级脱水。脱水后的材料仍按前述方法经11的无水乙醇:二甲苯(过夜、二甲苯(2次,每次2h透明,直到材料完全透明为止。在透明的过程中,若材料周围出现白色雾状浑浊,表明材料中的水没脱净,应退回纯酒精中重新脱水,再进行透明操作。2.3浸蜡与包埋室温浸蜡1 2d:向盛有材料及二甲苯的试剂瓶中加入少

11、许蜡粉,待其完全溶化后再加入一些蜡粉,直至蜡粉不能溶解,与二甲苯形成糊状的混合物。室温浸蜡后,打开试剂瓶上的玻璃塞,将试剂瓶移入40鼓风干燥箱中,让二甲苯慢慢蒸发,放置3 4d。此后,将鼓风干燥箱调至65,把原溶液换成熔融的纯蜡,每隔2h 换一次纯蜡(共换3次。将石蜡及其中的材料倒入预先贴上和试剂瓶一致标签的纸盒中,用加热的镊子把材料整理好。应注意切面朝下、位置放正、蜡要充满。2.4切片与粘片切片前,拆去纸盒,将蜡块修成上下两边平行的正方形或长方形,粘在小木块支座上。用切片机夹好小木块支座,将蜡块切成5 8m厚的薄片。切下的薄片自然形成蜡带,用毛笔小心取下蜡带,放在黑纸上备用。将涂有粘片剂的载

12、片放置在展片台上,涂有粘片剂的一面朝上,将展片台温度调到40,用记号笔在载片左上角做好编号(如:310,表示第三个材料的第10张装片,用胶头滴管在玻片中央滴少许蒸馏水,蒸馏水的多少视蜡带长短而定。若蜡带较窄,可考虑在载片上放置2 3排蜡带。用单面刀片将黑纸上的蜡带分成数小段,长度要略短于玻片上的蒸馏水区,用镊子和解剖针将蜡带小心转移到蒸馏水上,蜡带受热后会慢慢平展。待完全平展后,用解剖针将切片位置拨正,倾去载片上余水或用吸水纸放在载片边缘吸去多余水后,按照从上到下的次序从展片台左上角依次排列载片。展片台上可容纳约60张载片,待最后一批载片(10张一批做好后,最先粘有切片的载片多已烤干。将烤干的

13、载片依编号顺序放入染色架中(可放置30张玻片,粘有切片的一面朝上放置,移入37鼓风干燥箱内烘12h以上。2.5染色、脱蜡、透明与封片从鼓风干燥箱中取出的染色架可直接放入番红染液中浸染,不经过脱蜡和复水的步骤,染色时间在12h以上。染好后的载片用流水(自来水或蒸馏水,水流不要太大冲去多余染料,此时载片上的植物组织被染红,而石蜡未被染色。将冲洗后的染色架(上有载片再次放入37鼓风干燥箱中干燥后,依次浸入二甲苯5min、1%固绿(95%乙醇作溶剂染液2 3s进行分色、100%乙醇中5min进行脱水、11的无水乙醇:二甲苯中5min进行再次脱水和一次透明、纯二甲苯5min进行二次透明。将二次透明的染色

14、架放置在托盘中以防止二甲苯滴漏。将染色架上一侧的15张装片取出,按编号顺序在干净白纸上从上到下排好,切片面向上。用玻棒蘸取中性树胶,在每张装片中央滴一滴(若切片带较长或载片上有2 3排切片,可于切片带中央滴一大滴,两侧各滴一小滴中性树胶并加盖盖玻片。若树胶过少,可用蘸有树胶的玻棒在盖玻片的边缘补足。将做好的装片水平放置在35鼓风干燥箱中烘干(1 2d后,用小刀刮去装片两侧多余的树胶,按编号顺序放置到切片盒中。3实验结果经过上述改进方法制得的永久装片,其组织完整、细胞界限清晰、色彩鲜艳、颜色对比鲜明、切片干净,表明改良植物组织石蜡制片法所制得的装片和常规方法在制得的装片质量上无明显差别甚至更好。

15、不脱蜡就进行染色的装片,由于石蜡本身对光的反射和折射,液泡中或细胞质与液泡的界面可见许多形状不规则的较明显条纹,且由于凝固的石蜡本身不透明,细胞内的结构分辨较模糊,但大多数细胞中仍可见到细胞核甚至核仁,细胞核与细胞质间的界限也较清楚(图1中a、b。而在染色后脱蜡的装7317卷11期王静等常规植物石蜡制片技术的改进及应用片中,不会观察到上述条纹,且细胞结构更清楚(图1中c 、d 、e 、f 。凹叶木兰雌雄蕊的细胞核染成红色,细胞质呈现绿色、蓝绿色或蓝紫色,组织细胞的纤维素细胞壁呈现粉红色(图1中c ,且不论是幼嫩花还是成熟花的组织结构都比较清晰(例如发育早期的大孢子孢原细胞和小孢子母细胞、成熟的

16、花粉囊及其中的花粉粒。此外,花被片纵切面的结构也很清楚(图1中f 。在传统方法制片的过程中,由于粘片剂对表面凹凸的花粉附着能力较差,造成发育成熟的花粉囊和散粉后的花粉囊中所含花粉极易掉落。同时,在脱蜡、复水、染色和反复脱水、透明的过程中,附着能力差的花粉极易从载片上脱落。但在改良的制片方法中,切片不脱蜡就进行染色,由于石蜡的支撑、固着作用和切片反复浸入溶液的次数减少,使得最后制得的装片中不但发育成熟的花粉粒没有掉落,而且死亡解体的花粉空壳、败育花粉粒和散粉后残留在花粉囊中的花粉粒都没有丢失(图1中b 、c 、d 。图1凹叶木兰的花器官组织切片注:a :经过一次染色未脱蜡的切片,孢原细胞;b :

17、经过一次染色未脱蜡的切片,散粉后的花粉囊,示残留空壳花粉粒;c :分色后脱蜡的切片,成熟花粉囊;d :分色后脱蜡的切片,小孢子母细胞;e :分色后脱蜡的切片,孢原细胞;f :分色后脱蜡的切片,花被片横切面。4讨论4.1常规石蜡制片方法与改良方法的比较从表l 看出,实验中2种方法在时间安排和步骤上有所不同,改良石蜡制片法在“脱水、透明、浸蜡、染色、分色”上进行了简化和优化,使得整个制片程序更易操作,并且节省了药品、缩短了与有毒物品接触时间。此外,常规方法的时间安排具有连续性和不可中断性,对试验工作者精力要求较高。改良方法可解决该问题,即:包埋前的脱水和透明过程中最后一步都可以过夜,因此这两步可各

18、花1d 时间进行;浸蜡时可以一天分3次加蜡粉(早,中,晚,其余时间自行安排;由于包埋材料的蜡块可永久保存且不脱蜡染色的载片也可保存很长时间,故包埋后的工作也可自由安排时间进行,试验者可同步处理其他工作,提高了试验效率。表1两种植物石蜡制片方法比较制片步骤传统实验方法改良方法脱水(经70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇梯度脱水(,每级2h缩短在无水乙醇中脱水时间,增加90%的乙醇作为一个梯度浓度进行脱水透明经11乙醇二甲苯、二甲苯(、二甲苯(透明,每级lh ;材料在每级透明剂中浸泡时间不同浸蜡37二甲苯饱和石蜡溶液48h 浸蜡,65间隔2h 换2次纯蜡增加常温浸蜡步骤,

19、延长37浸蜡时间包埋常规包埋与常规方法相同切片轮转式切片机8 10m 切片与常规方法相同脱蜡(经二甲苯2次、每次10min 无此步骤复水经l1二甲苯乙醇15min ,100%乙醇5min ,100%乙醇5min ,95%乙醇5min ,85%乙醇5min ,70%乙醇5min ,蒸馏水5min 无此步骤染色经1%番红过夜与常规方法相同脱水(经35%乙醇lmin ,50%乙醇lmin ,60%乙醇lmin ,70%乙醇lmin ,85%乙醇lmin ,90%乙醇lmin ,95%乙醇lmin 无此步骤脱蜡(无此步骤经二甲苯中5min分色1%固绿6s缩短在1%固绿中的时间,2 3s 脱水(经100

20、%乙醇(1min ,100%乙醇(1min100%乙醇中5min透明(经11二甲苯乙醇1min ,二甲苯(1min ,二甲苯(11无水乙醇二甲苯中5min ,纯二甲苯中5min 封片中性树胶封片与常规方法相同注:传统实验方法710。4.2样品脱水、透明步骤的优化处理石蜡切片法是否成功最重要的就是脱水和包埋步骤,若植物组织中水未脱尽,残留的水分与二甲苯和石蜡不相溶,会使包埋、切片失败。因此,采用带塞的玻璃广口试剂瓶对实验材料进行脱水处理可有效避免吸收空气中的水分。此外,通过更换杯中溶液来代替将材料在不同溶液试剂瓶转移的方式可使操作更为简便,且避免了由于频繁移动材料而造成损坏或丢失的问题。与常规方

21、法相比,改良方法为避免材料在无水乙醇中浸泡时间过长造成材料收缩变形,并提高脱水效率,增加了90%的乙醇作为一个梯度浓度进行脱水的步骤。在改良方法透明的步骤中,因为二甲苯有毒、易吸水、易挥发,因此使用二甲苯时要随时盖紧盖子并迅速完成更换每级透明剂操作。4.3浸蜡及包埋技术的优化浸蜡是将包埋剂替代透明剂且渗透、支撑整个组织并稳定其结构的过程。改良方法中的浸蜡步骤采用直接向试剂瓶中加蜡粉法,蜡粉会充分和试剂瓶中二甲苯接触并快速溶解。在不断加蜡粉的过程中,由于溶液迅速成为二甲苯的石蜡饱和溶液,使得石蜡会均匀地渗透到组织内部,浸蜡效果更好。浸蜡期间要保持恒温箱的温度恒定,切忌忽高忽低。除去透明剂是一件极

22、其重要的工作,一定要彻底、干净,否则包埋时石蜡中有结晶现象,影响后期切片,因此在40恒温浸蜡后将温箱温度上调至65,采用多次换蜡的措施保证将试剂瓶83安徽农学通报,中溶液换成纯蜡,且要在最短时间内完成浸蜡,以免引起材料变硬、变脆、收缩。浸蜡时间也应该根据材料的性状和大小进行适当调整,一般情况下,体积小且幼嫩的材料浸蜡时间要比体积大、质地坚硬的材料短些。此外,浸蜡与包埋要一次完成,以防操作过程中出现温差。4.4切片和展片时的注意事项切片成败不仅与切片前的系列处理有关,而且与切片的操作也密切相关。切片时用力应均匀,不宜过重过快,否则易造成切片厚薄不均。如果出现蜡带弯曲不直,应将蜡块取下,将两边修平

23、且调节夹物隔,使蜡块和刀片平行。若切片不能连成带或卷起成圆筒状,可能是由于室温过低或刀的倾角太大等原因,可在切片机旁边安置一盏白炽台灯用以升高切片机周边温度,同时减小刀的倾角;若切片还卷成筒,可用毛笔笔尖将初次切出的1 2片切片轻轻压住,随后即可切成连续蜡带。如果切片粘附于切片刀上或不能成带皱缩在一起,可能是由于室温过高或石蜡过软,可将蜡块放入冰箱中1min左右或投入冷水中浸泡片刻取出,并用蘸有二甲苯的绸布清洁刀口。若此法不行,应选用质地较硬的石蜡对材料进行重新包埋。若切片发生纵裂,可能是刀口出现缺口或蜡块含有较硬的颗粒物质,可移动刀片,使蜡块置于新的无缺的刀口下,或去除蜡块中的异物。展片时,

24、若展片台温度过高,将使石蜡熔化并浮于材料表面,造成冷却后在材料表面形成一层蜡膜,使材料无法染色。因此,展片的温度不宜超过50。4.5染色程序的简化和封片过程中的注意事项由于染料不能进入石蜡,常规的石蜡切片染色方法要在脱蜡和复水后进行。但在切片过程中发现,切片的植物组织断面上无石蜡覆盖,且染料可经植物组织断面吸收。通过反复尝试,发现切片不经脱蜡和复水也可染色,制成的装片比脱蜡后染色的装片效果好,且很少发生在传统切片法中出现的花粉母细胞脱落和胚囊脱落的现象。不脱蜡就进行番红的染色对比传统实验方法有不少优点,即:(1省去常规脱蜡染色法中脱蜡后水化(经下行梯度酒精及染色后脱水(经上行梯度酒精的步骤,这

25、样既大大简化了染色手续,同时又节省了药品和时间;(2载片接触溶液的次数较传统方法少,因此,有些在常规染色过程中极易脱落丢失的成分(如孢子、花粉粒、胚囊等,在改进方法中较完整地保留下来;(3切片在不脱蜡时,其机械强度比脱蜡后要高很多,因此,在直接染色过程中,不脱蜡的切片可以反复地经受染色、水洗、干燥,也能耐受擦拭,不会出现由于一时操作不慎将切片擦脱、划伤等情况;(4常规染色的切片在显微镜下观察染色效果时,最忌讳切片干燥而引起组织、细胞结构的收缩或破坏。因此,只能在染色过程中匆忙、大略地检查染色效果,而在封片后发现染色效果差难以补救。不脱蜡染色的切片不怕干燥,在染色后脱蜡以前,可以在显微镜下仔细检

26、查切片,正确地决定切片是否需要继续染色或是进行下一步脱蜡、分色。此外,对连续切片的材料在染色之后,脱蜡前就可以在显微镜下进行初步挑选,只拣出有用的切片脱蜡、封藏,提高了工作效率;(5染色的切片可以放在切片盒中不脱蜡长期保存,或对未脱蜡已染色的切片分批进行处理,这样既节省时间又可得到一致的染色效果。切片染上红色后,在流水上冲去多余染料,烘干后可直接脱蜡,然后不复水进行分色。经过反复实验,发现尽管第一次不脱蜡染色效果好,但若不脱蜡进行分色,会造成第二次染色上色不均匀,效果不好。为使染出的切片效果统一,建议使用染色架,每次染数10张甚至上百张载片(同时准备数个染缸,每个染缸可放1个染色架,1个染色架上可放30张载片。本方法虽然