生化与分子生物学实验指导

1、生化与分子生物学实验指导-()作者:日期:实验一氨基酸纸层析法、实验目的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。二、实验原理纸层析法（paper chromatogra phy）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的称下行法。将样品点在滤纸上（此点称为原点）,进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂 中不断进行

2、分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用 Rf值表示：原点到层析斑点中心的距离R =原点到溶剂前沿的距离f在一定条件下某种物质的R f值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条 件（如温度、展层溶剂的组成）不变 ，Rf值是常数，故可根据R f值作定性判断。样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的 Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此， 当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目

3、的，这种方法称为双向纸 层析法。氨基酸无色，可利用苛三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。所有氨基酸及 具有游离a -氨基的肽与苛三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与苗三酮反应产生（亮）黄色物质。三、药品器材1器材层析滤纸（新华1号卜喷雾器、剪刀、层析缸、毛细管、电吹风、刻度尺、铅笔。2试齐1J（1）氨基酸溶液：赖氨酸、脯氨酸、缴氨酸溶液以及他们的混合溶液（各组分浓度0. 5%）。（2）展层剂：V正丁醇（A. R.） :V（80% 甲酸）:V （水）=15:3:2 （3）显色剂：0. 5g苛三酮溶于1 00mL无水丙酮，贮存于棕色瓶中备用。 四、实验方法1 .滤纸准备：选

4、用新华1号滤纸，裁成5cmx 2 0 cm的长方形，在距纸一端2 cm处用铅笔轻轻划一基 线,在线上每隔1 cm作一记号，标出4个原点。2 .点样：用毛细管将氨基酸样品分别点于原点（用量1020uL）,用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复23次，点子直径不能超过3 mm。3 .展层:将点好样的滤纸放入装有展层剂的展层缸内盖展层缸进行展层，展层剂液面不能淹没原点基线,当溶剂上升至1 520cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿线，把滤纸烘干。4 .显色:用喷雾器在滤纸上均匀喷上显色剂，用热风吹干，层析斑点即可显现。5 .结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距

5、离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 Rf值，与标准氨基酸的Rf值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。五、实验结果及分析六、思考题影响氨基酸R f值的因素有哪些？实验二甲醛滴定法测定氨基氮、实验目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。、实验原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：N H 3是弱酸，完全解离时PH为11 -12或更高，若用碱滴定NH3所释放的H卡来测定氨基酸，一般指示剂变色点。常温下，甲醛能域小于10,很难准确指示滴定终R-CH-COO R-CH-CX-十 HI而叫迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH 3释放H+,使溶液的酸度增

6、加，滴定中和终点移至酚酬:的变色域内(PH9. 0左右)。因此可用酚酬:作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。RYHTTOS R-CH-COO- +r 附°:)中和L 加2HCHD 山 R'CTi-COO- NHCE20H Ihcho 艮-chyoctN(CH2OH)2如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。三、器材及试剂1 .实验器材25ml锥形瓶；3m 1微量滴定管；

7、吸管；研钵。2 .实验试剂(1 )3 0 0ml 0.05mo 1 /L标准甘氨酸溶液准确称取3 75mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。（2） 5 00ml 0 . 02mo l/L标准氢氧化钠溶液20m 1酚Mt指示剂0.5 %酚酬:的50 %乙醇溶液。（4） 400 ml中性甲醛溶液在50ml 3 6 3 7 %分析纯甲醛溶液中加入1m 1 0 .5%酚酗:乙醇水溶液，用 0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。四、实验方法1、取3个2 5 ml的锥形瓶，编号。向1、2号瓶内各加入0. 0 5mol/L标准甘氨酸溶液2ml和水5ml, 混匀。向3号瓶内加入 7 m

8、l水。然后向三个瓶中各加入 5滴酚Mt指示剂，混匀后各加2 m 1甲醛溶 液再混匀，分别用 0. 0 2 m o 1 /L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。2、取未知浓度的甘氨酸溶液2ml,依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。五、结果处理1 .回收率计算：甘氨酸氨基氮回收率%=头际源行里X 100加入理论量公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以

9、14.008。2 .氨基氮计算：（V 未一V 对）XN N a OH X氨基氮（毫克/毫升尸14. 0082公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。V对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NNa OH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。六、思考题为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的一NH3+基上的H+,不能用一般的酸碱指示剂?实验三葱酮比色定糖法一.实验目的：1 .学习分光光度法的基本原理2 .学习对蔬菜和食品中糖含量进行测定的方法二.实验原理1 .分光光度法基本原理：溶液中的物质在光的照射激发下，产生对光的吸收效应，不同的物质具有各自选择性的吸收光谱，因此，当某单色光

10、通过溶液时，能量会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质浓度有一定比例关系，即符合于比色原理一一比尔定律。2 .朗伯-比尔定律A= 1 g (1/T ) =KbcA:为吸光度，T:为透射比，是透射光强度比上入射光强度c:为吸光物质的浓度b：为吸收层厚度K:比例常数3 .物理意义当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，起其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。4 .慈酮比色法意铜比色法是一个快速而简便的定糖方法。意酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖 及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色，在6 2 0nm处有最大吸收。意酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品

11、中存有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于特 定的糖类，反应较稳定。本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。3 .实验试剂(1)慈酮试剂：取0. 2 gK酮溶于100mL 8 0 %(V/V)硫酸中,当日配制使用；(2 )标准葡萄糖溶液(0.1mg/ m L):(可滴加几滴甲苯作防腐剂 );(3)糖样品溶液。4 .实验步骤1.制作标准曲线：取干试管6支，依次加入标准糖溶液 0, 0. 2, 0 .4,0 .6, 0 .8, 1 . 0 ml,并依次用蒸储水补 足体积到1mL,各管均加入慈酮试剂 4mL，沸水浴准确煮沸10min,室温放置10m i n,用1号试管溶 液调零

12、，比色测定 A620O用标准糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。管号？1 #2#3#4#5#6#7#标准葡 萄糖溶 液(ml)00.20. 40.60.81 . 00蒸储水 (ml)1 . 00. 80 .60. 40.20样品液/1.0(ml)置冰水浴中冷却5min恿酮试剂(ml )4. 04 . 04.04. 04. 04 . 04.0沸水浴中准确加热10min,取出，用自来水冷却，室温放置1 0minA620nm糖溶液 浓度 (mg/m1)00.020.040. 060 .080. 1 0待测2.样品含糖量测定：无蛋白糖溶液样品溶液稀释100倍，吸取1mL置试管中，再加入4

13、 mLB酮t剂，沸水浴中煮沸10分钟，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量(mg/ml )。五、实验结果1 .制作标准曲线2 .计算样品中糖浓度六、思考题H2 SO 4在实验中起什么作用?酪蛋白的制备一、实验目的1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白 ，含量约为3 5g/Lo酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4. 7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。三、材料、试

14、剂与仪器1 .材料新鲜牛奶2 .试剂(1) . 95%乙醇1 200mL(2)无水乙醛1 200mL(3) 0. 2mol/L pH4 . 7醋酸一醋酸钠缓冲液300m l先配A液与B液A液。2mol/L醋酸钠溶液称NaAC-3H2O 5 4.44g,定容至2 0 00ml。B液：0.2m o l/L醋酸溶液，称优 纯醋酸(含量大于9 9.8%) 12.0g定容至1 0 00m 1。取A液1770m 1 ,B液1 230m 1混合即得P h4.7的醋酸醋酸钠缓冲液 3000ml。(4)乙醇一乙醛混合液乙醇：乙醛=1 : 1 (V/V)3.仪器离心机、抽滤装置、精密pH试纸或酸度计、电炉、烧杯、

15、温度计四、操作步骤1 .酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至40C。在搅拌下慢慢加入预热至 40C、pH4. 7的醋酸缓冲液 100mL.用 精密p H试纸或酸度计调p H至4. 7。 将上述悬浮液冷却至室温。 离心15分钟(3000 r /min)。 弃去清液，得酪蛋白粗制品。2 .酪蛋白的纯化(1)用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟(3 000r/min),弃去上清液。(2)在沉淀中加入 30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇一乙醛混合液洗沉淀2次。最后用乙醛洗沉淀2次，抽干。(3)将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。3.准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白g /

16、100 mL牛乳（g%）得率：鹦瞿乂皿式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。五、实验结果及分析六、思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量、实验目的1 .掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2 .熟练分光光度计的使用和操作方法。二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在 46 5 nm,当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为5 95nm。考马斯亮蓝 G-2 5 0蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内,59 5 nm下光密度与蛋白质含

17、量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。离心机的使用说明：1 .要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。2.离心管的放置是对角线放置，要求必须称。3.先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。分光光度计的使用说明：1 .接通电源开关，预热 20min后，再选择须用的单色光波长。2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿(溶液装入4/5高度，置第一格)置于光路上，调节 100%透射比按钮，使吸光度值

18、A=0.0 0。3推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。三、试剂与器材：1 .试剂：(1)0.9%NaCl 9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。(2)标准蛋白质：称取5 0 mg结晶牛血清蛋白定溶于5 0 ml容量瓶里。(3)染液：考马斯亮蓝G 25 00.5g,溶于250mL 95%乙醇,再加入50 0 mL 8 5% (W/V)磷酸,保存于棕色瓶中，称为母液。取15 0 mL然后加蒸储水定容到 1000mL，保存于棕色瓶中，备用。2 .器材：试管；吸管10mL、l5mL、lmL、0

19、.1mL; 7 22分光光度计四、操作方法1 .标准曲线的制备取6支试管，按下表加入各试剂管号？012345标准蛋白溶液（m 1 ）00. 20.40. 60 .81 . 00 . 9%M C1溶液 (ml)1 . 00 . 80.60 .40. 20待测样品（ml）/考马斯亮 蓝试剂（ml）5. 05 . 05.05 .05. 05. 0摇匀，放置5min,测吸光度值A595n m以各管相应标准蛋白质含量（ mg）为横坐标、A 5 9 5为纵坐标，绘制标准曲线。2 .待测样品测定试管中加蛋白质样品 1.0 mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝 G- 2 50试剂，摇匀，放置 5m i n 后，在

20、5 95nm波长下吸光度值，记录 A 5 95。根据所测A5 9 5从标准曲线上查得蛋白质含量。并 计算蛋白样品的浓度（mg/ml）。五、实验结果及分析六、思考题蛋白质含量的测定还有哪些方法 ？其优缺点是什么？影响酶促反应速度的因素一、实验目的通过本实验了解温度、PH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。二、实验原理唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种糊精和麦芽糖。淀粉溶液与碘反应呈蓝色；糊精根据分子大小，与碘反应分别呈蓝、紫、红、无色等不同的颜色；麦芽糖不与碘呈色。唾液淀粉酶的活性受温度、酸碱度、抑制剂与激活剂等的影响。温度：温度降低，酶促反应减弱或停止；温度升高，反应速度加快。当上升至某一温度时

21、，酶促反应速度达最大值，此温度称为酶的最适温度。由于酶的化学本质是蛋白质，温度过高会导致蛋 白质构象的改变，因此如果温度继续升高，反应速度反而会迅速下降甚至完全丧失。酸碱度：唾液淀粉酶最适pH为pH6 . 9,高于或低于酶的最适 pH值，都将引起酶活性的降低,过 酸或过碱的反应条件可使酶活性丧失。抑制剂与激活剂：酶的活性常受某些物质的影响，能增加酶的活性称为酶的激活剂：降低酶活性且不使酶蛋白变性的称为酶的抑制剂。如Cl-为唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。根据上述性质，可以用碘检查淀粉是否水解及其水解程度，间接判断唾液淀粉酶是否存在及其活性大小。三、试剂及器材1 .试剂：1%粉

22、溶液,1 %氯化钠溶液，1%硫酸铜溶液，1%硫酸钠溶液,碘液，磷酸氢二钠(0. 2 m mo l/L ),柠 檬酸溶液(0. 1 mmol/L)。2 .器材：试管，试管夹，恒温水浴锅(37 C ),吸管，滴管，试管架。四、实验操作：1 .收集唾液：实验者先将痰咳尽，用自来水漱口， 清除口腔内食物残渣，再含蒸储水约15 mL作 咀嚼咕漱运动，3 min后吐入小烧杯中备用。2 .观察温度对酶促反应速度的影响取试管3支，编号1 ,2,3 ,按下表操作试剂(m l)123错误!唾液111错误! 1%淀粉222oac(0,1 )错误！水浴5mi n10 0c （冷却）37 C0 c碘液1滴（冷却）1滴1

23、滴现象3.观察pH对酶促反应速度的影响 （1）配制一系列pH不等的缓冲液。试齐J ( ml)1230 .2mm o 1/ L 磷酸氢二 钠5. 1 57. 7 29.72O.lmmol/ L柠檬酸4.852. 280. 2 8P H5.006.808.00（2）取试管3支，编号1 , 2 , 3，按下表操作：试剂（m 1 ）123唾液222缓冲液3 (pH5.0 0 )3 (pH 6 .80)3(pH8. 00)1%淀粉2223 7c水浴 10mi n碘液1滴1滴1滴现象4观察激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响取试管4支，编号1,2,3 , 4,按下表操作：试剂滴12341%淀粉2 02020

24、20唾液101 0101 0蒸储水6一一一1 %氯化钠一6一一1喻酸铜一一6一1喻酸钠一一一63 7c水浴 5-1 0 min碘液1滴1滴1滴1滴现象五、实验结果及分析六、思考题影响酶促反应速度的因素有哪些？它们如何影响酶的活性实验七酶的活性及专一性测定一、实验目的通过本实验，了解酶的活性测定方法及其对底物催化的专一性。二、实验原理唾液淀粉酶能专一的催化淀粉水解，生成一系列水解产物，即糊精、麦芽糖、葡萄 糖等。麦芽糖或葡萄糖都属于还原糖，能使班氏试剂中的二价铜离子还原成亚铜，并 生成砖红色的氧化亚铜。淀粉酶不能催化蔗糖水解，且蔗糖本身不是还原糖，所以不能与班氏试剂作用呈色，以此证明酶催化底物的

25、专一性。三、器材及试剂1 .器材:试管、试管夹、样品杯、滴瓶、温度计、恒温水浴箱 ，冰箱等。2 .试齐J:(1)0. 5 %淀粉溶液(含0.3%NaCl):称取可溶性淀粉0. 5 g ,力口 5ml蒸储水调成糊状, 徐徐倒入8 0ml煮沸的蒸储水中，不断搅拌,待其溶解后，加0.3gNaCl,加蒸储水至1 00mlo此液应新鲜配制，防止细菌污染。(2) 2 %蔗糖溶液：称2g蔗糖，加蒸储水至100ml溶解 班氏试剂：溶解结晶硫酸铜17.3g于100ml热的蒸储水中，冷却后加水至1 50ml为A 液。取柠檬酸钠17 3g和无水碳酸钠100g加蒸储水600ml，加热溶解，冷却后加水至8 50ml为B

26、液。将A液缓慢倒入B液中，混合即可。(4)稀释口液：用清水漱口，清除食物残渣。再含蒸储水15ml作咀嚼运动，2分钟后将稀释 唾液收集于样品杯中备用。(5 )碘-碘化钾溶液：四、实验方法1 .唾液淀粉酶的活性测定唾液的稀释：取1 0支试管，分别编上号1 6, Ml ml唾液加入1号试管，加水稀 释10倍后从中取出1 m 1加入2号试管，依次梯度稀释。试剂管号123456唾液(ml)111 <-11 .1蒸储水(ml)9心 匠叉各取上述稀释的唾液各1 ml,分别加入相应编号的试管里，然后向 6支试管内同时 加入1 ml的0.5 %的淀粉溶液，振荡混匀后放入 37 C恒温水浴中，10分钟后取出

27、，滴 加2滴碘液，振荡混匀，观察颜色，选取颜色变化适中的一支，记录稀释倍数，计算酶的活 性，用于后续实验。2 .淀粉酶的专一性取3个试管，分别编号，按下表操作，记录实验现象试管编号1 #2 #3#稀释的唾液淀粉酶/mL1110 . 5%淀粉溶液/mL32%蔗糖溶液/mL3蒸储水/m L3摇匀，37c保温15m i nBen edict 试齐1J/mL222摇匀沸水煮2分钟观察记录结果五、实验结果及分析六思考题每组中蒸储水分别起什么作用？将酶煮沸 10min,重复以上实验可能会有什么结果？实验八维生素C的定量测定一、目的要求1. 学习并掌握定量测定维生素c的原理和方法。2. 了解蔬菜、水果中维生

28、素 C含量情况。二、实验原理维生素C是具有L系糖型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分 及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等 ）中的含量更为丰富。维生素C具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能还原染料2,6二氯酚靛酚（DCPI P）,本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2, 6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生 素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的 维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素 C刚

29、刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所 还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。三.材料、器材及试剂1 .材料：新鲜青菜2 .器材：电子天平，酸式滴定管，移液管，容量瓶，量筒，锥形瓶，研钵。3 .试齐I(1)2%草酸溶液：草酸1 g溶于10 0 m l蒸储水中。(2) 2 , 6-二氯酚靛酚溶液：2 50mg 2 , 6 -二氯酚靛酚溶于 15 0ml含有52 mg NaH C O 3的热水 中，冷却后加水稀释至 2 5 0ml,贮于棕色瓶中冷藏(4C)约可保存一 周。每次临用时，以标准抗 坏血酸溶液标定。(3)标准抗坏血酸溶液(0.2m g /m 1 ):

30、准确称取20mg纯抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不 能用)溶于2 %草酸溶液中，并稀释至100ml,贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用前配制。四.操作步骤1 .样品的处理和提取(1)取材 淋取4 .0g样品洗净、切碎。(2)研磨：样品置研钵中，加少量2%草酸溶液研磨成汁液，用2%草酸溶液冲洗转移至50 ml离心管,3 0 00r/m i n离心1 5 min,上清转移到5 0 ml容量瓶中,2%草酸溶液定容至5 0ml。2 .空白测定取2%草酸10ml,放入5 0 ml三角瓶中，用2, 6 -二氯酚靛酚钠溶液滴定至三角瓶内溶液呈粉 红色，15秒内不褪色为终点，记录所用滴定液体积，重复三次取平均值

31、。3 .标定2,6-二氯酚靛酚钠溶液取2ml标准抗坏血酸溶液加 8ml 2%草酸溶液，置于5 0m 1三角瓶内，用2,6-二氯酚靛酚钠溶 液滴定至终点，记录所消耗2, 6-二氯酚靛酚钠溶液的量，重复三次取平均值。4 .样品的测定取样品液1 0ml,放入5 0ml三角瓶中，立即用2, 6二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的 粉红色并保持15秒内不褪色，记录所消耗滴定液的体积，重复三次取平均值。五.实验结果及分析X = (V1-V 2 )*K * V* 1 0 0/ (W*V3 ) K= 0 . 2*2/(V 0 V2 )其中x 1 0 0克样品所含维生素C毫克数(mg/1 0 0g)W一称取样品重(

32、g)V0 标定染料时滴定标准维生素C所消耗的染料毫升数V1一滴定样品所用染料毫升数V 2 一滴定空白所用样品液毫升数V3 一样品测定时所用样品液毫升数V 一样品提取液稀释之总体积K 1毫升染料液所能氧化维生素 C之毫克数六、思考题本实验方法的优缺点有哪些 ？实验九 质粒DNA的提取与检测一、实验目的1、学习质粒 DNA的提取原理与琼脂糖凝胶电泳原理；2、掌握质粒DNA 的提取方法； 3、掌握电泳检测 DNA的方法。二、实验原理质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子 ，大小从1 -2 0 0k b 不等，为双链、闭环的 DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放

33、线菌和真菌细胞中，它具有 自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋D NA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张 力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open ci r c ul a r DNA, 简称oc DN A);如果质粒DNA的两条链在同一处断裂， 则形成线状DNA (Linear DNA)。当提取的质粒 DNA 电泳 时，同一质粒DN A 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。琼脂糖凝胶

34、电泳是分离鉴定和纯化 DN A片段的标准方法。琼脂糖主要在D NA 制备电泳中 作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性p H值下带负电荷的DN A向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定 ：DNA 的分子大小，琼脂糖浓度,DNA分子的 构象，电源电压，嵌入染料的存在及离子强度等。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的 DNA 片段。 当用低浓度的荧光嵌入染料澳化乙咤( Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以 检出1 10ng的DNA条带，从而可以确定D N A片段在凝胶中的位置。三、材料、设备及试剂1 .材料

35、：含pET3 2 a的E. coli DH 5 ”菌株，1.5ml塑料离心管(又称e ppendorf 管)，离心管架。2 .设备：台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器，移液枪(20 6,2001 ,1 0 0 0 1)及枪头，琼脂糖平板电泳装置，微波炉或电炉，紫外透射仪。3.试剂(1) L B液体培养基： 酵母膏5 g ，蛋白月东10g ,NaCl 10g,加蒸储水至1000ml ,用NaOH 和HCl调节p H 7 .07.2，分装灭菌。(2) LB固体培养基：加1 .5%琼脂粉的LB液体培养基，灭菌倒平板。(3)氨茉青霉素(Am p ic i l 1 i n

36、 , Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20C保存备用。(4)溶菌酶溶液：用10mmol/L Tri s H C l(pH8.0 )溶液配制成10m g /m 1 ,并分装成小份(如1.5 ml) 保存于20 Co(5) 3mol/l NaAc (p H5.2):50m 1 水中溶解 40.81g Na A c?3H2O,用冰醋酸调 pH 至 5 . 2 ,力口 水定容至100m 1 ,分装后高压灭菌，储存于4 C冰箱。(6)溶液 I: 5 0 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris. Cl (pH8.0) , 10mmol/L E D TA (pH 8 . 0)。溶液I可

37、成批配制，每瓶100m 1 ,高压灭菌1 5分钟，储存于4 c冰箱。(7)溶液 n : 0 .2 mo 1 /L NaOH (临用前用 1 0 mol/L NaOH 母液稀释)，1 % SDS。(8)溶液出：5 mo l/L KAc 60m 1 ,冰醋酸 1 1 . 5ml, H2 O 28. 5ml,定容至 100ml,并 高压灭菌。溶液终浓度为 ：K+ 3 mol/L, Ac - 5mol/L。(9) RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisHCl(pH7.5), 1 5 m mol/L Na C l 中，配 成10mg/ml的溶液，于10 0 C加热15

38、分钟，使混有的D NA 酶失活。冷却后用 1.5m 1 eppen do rf管分装成小份保存于-20C。(10)酚:氯仿:异戊醇=2 5 : 2 4:1 (V/V/V)。(11) TE 缓冲10 mmo/L TrisHCl (pH8.0),1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压 火菌后储存于4 C冰箱中。(12)电泳所用试剂：.TBE 缓冲液(5 X)：称取 Tris 5 4g,硼酸 27.5g,并加入 0 . 5M ED TA(pH 8 .0) 20m 1 ,定溶 至 1000ml。 .上样缓冲液(6X):0. 2 5%澳酚蓝，40 % (w/v)蔗糖水溶液。 .澳化乙锭(:将E

39、B配制成1 0 mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。四、操作步骤1 .细菌的培养和收集将含有质粒p ET 32 a 的DH5 ”菌种接种在L B固体培养基(含50科g/ml Amp)中， 37 c培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5m 1 LB液体培养基(含5 0 g /mlAmp)中,37 C振荡培养约12小时至对数生长后期。2 .质粒D NA快速提取(1)取1 .5ml 培养液倒入1. 5ml ep pendorf 管中，4C下1 2000g 离心、3 0秒。(2)弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。(3)菌体沉淀重悬浮于 10 0dl溶液I中(需剧烈振荡

40、，室温下放置5-10分钟。(4)加入新配制的溶液H 2 0 0 l,盖紧管口，快速温和颠倒eppe nd o rf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5分钟。(5)加入1 5 0 l预冷的溶液出，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4c下12000g离心5-10分钟。(6)上清液移入干净e ppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿(1 : 1)，振荡混匀，4C下12 0 0 0 g离 心5分钟。(7)将水相移入干净e ppendorf管中，加入2 倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于20c冰 箱中2 0分钟，然后4c下1 200 0 g离心1 0分钟。(

41、8)弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次，4C下12 000 g 离心5-10分钟。(9)吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥1 0分钟或室温干燥。(10)将沉淀溶于 206 TE缓冲液(pH8. 0,含2 0 dg /ml RNa s eA)中，储于-2 0C冰箱中。3 .质粒DNA的检测1、取5XTBE缓冲全取2 0ml加水至2 00ml,配制成0. 5 X TBE 稀释缓冲液，待用。2、胶液的制备：称取 0.4g琼脂糖，置于2 0 0ml锥形并S中，加入5 0ml 0.5X T B E稀释缓冲液, 放入微波炉里（或电炉上）加热至琼

42、脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约1 c m ）紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上 插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气 泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5XTBE稀释缓冲液至液 面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要 注意保证样品槽中应注满缓冲液。4、加样：取1 0科l DNA与26 6X载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样 品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样