毕业论文A0稿

1、长沙医学院毕业设计(论文)课 题 名 称蔓荆子总黄酮中主要化学成分的研究 学 生 姓 名陈 小 娟学号系、年级专业药学系、09级本科药学班指 导 教 师李 艳 辉曹丽芝 职 称 讲 师 主任药师2013 年05 月01 日诚信声明本文郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日目录中文摘要1Abstract2第一章引言4

2、1.1 蔓荆子化学成分研究4黄酮类化合物41.1.2 酚类41.1.3 苯丙素类4萜类、甾类化合物51.1.5 挥发油、氨基酸等其它成分51.2 黄酮类化合物的研究概况51.2.1 黄酮类化合物的分布51.2.2 黄酮类化合物的结构和分类61.3 黄酮类化合物的生理活性61.3.1 抗氧化及抗自由基作用61.3.2 对心血管系统的作用61.3.3 抗癌、防癌作用71.3.4 抗炎、抗菌、抗病毒作用71.3.5 泻下作用81.3.6 降血糖作用81.4 黄酮类化合物的开发与利用81.4.1 市场前景81.4.2 黄酮资源开发91.5 结语9第二章仪器与试剂102.1试剂与材料102.2仪器10第

3、三章提取分离113.1预实验113.2 TLC试验探索洗脱体系123.3 硅胶柱层析分离123.4聚酰胺柱层析分离123.5 硅胶柱层析分离流分1-413第四章结果与讨论16参考文献17致谢18蔓荆子总黄酮中主要化学成分的研究陈小娟长沙医学院2009级药学专业指导老师：曹丽芝 李艳辉中文 摘 要目的：蔓荆子为马鞭草科牡荆属单叶蔓荆(Vitex trifolia L. var. simplicifoliaCham.或Vitex rotundifolia L.)或三叶蔓荆(Vitex trifoliaL.)的干燥成熟果实，主要产于山东、广西、云南、江西、浙江、福建、及广东等地。为常用中药，具有疏散

4、风热、清利头目、止痛的功效，临床上用于治疗风热、感冒头痛、偏头痛等症。据报道，蔓荆子的主要活性成分是黄酮类化合物，为丰富蔓荆子的应用基础研究成果，为开发和利用传统中药蔓荆子,本论文对蔓荆子药材中黄酮类化合物进行了研究。方法：实验主要采用有机溶剂提取；聚酰胺柱层析；硅胶柱层析等方法。结果：从蔓荆子总黄酮中分离得到了12个混合组分，并分离出一绿色化合物。结论：可采用聚酰胺柱层析和硅胶柱层析的方法对蔓荆子总黄酮中的主要化学成分进行分离。关键词：蔓荆子；黄酮类化合物；分离纯化Studies ontheFlavonoids Constituents oftheFruitsof Fructus Vitic

5、is Department of Pharmacy, ChangshaMedicalUniversityXiaojuan ChenAdviser: Lizhi Cao Yanhui LiAbstractObjective：Fructus Viticis is the dried and ripe fruits of Vitex trifolia L. Var. simplicifoliaCham.or Vitex rotundifolia L.，which are plants belong to Vitex of Verbenaceae family. It distributes main

6、ly in Shandong，GuangxiYunnan，Jiangxi，Zhejiang，Fujian and Guangdong. It is a traditional Chinese medicine be widely used in clinical treatment. Because it has thefunctions of clearing heat，keeping mind clear and killing pain，so it can be used to treat fever，headache，migraine etc. It is reported that

7、flavonoids are main active constituents in Fructus Viticis. In order to better exploit and make good use of this medicine，in this paper we have made studies on flavonoids in fruits of Vitex trifolia L. var. simplicifoliaCham.Methods: In order to investigate the constituents in this plant, sever meth

8、ods have been used in the process of extraction and separation including polyamide chromatography column(CC), silca-gelCC，pre-TLC and so on. Result：12hybrid components and a pure green componend were isolated fromViticis totalflavonoids. Conclusion：Polyamide column chromatography and silica gel colu

9、mn chromatography methods can be used to separate the main chemical components in total flavonoids of Fructus Viticis.Key words: Fructus Viticis;flavonoids constituents; isolation and Purification第一章引言蔓荆子为马鞭草科牡荆属单叶蔓荆(Vitex trifolia L. var. simplicifoliaCham.或Vitex rotundifolia L.)或三叶蔓荆(Vitex trifoli

10、aL.)的干燥成熟果实，主要产于山东、广西、云南、江西、浙江、福建、及广东等地。为辛凉解表常用药，具有疏散风热、清利头目、止痛的功效，用于治疗风热、感冒头痛、偏头痛等症，民间有“云南天麻”之称。被收载于1977、1955、1990、2000、2005年中华人民共和国药典，系常用中药。1.1 蔓荆子化学成分研究关于蔓荆子化学成分的研究，据文献报道，从中分离的化学成分主要有黄酮类、酚类、苯丙素类、萜类和甾类化合物等。1.1.1黄酮类化合物目前从文献报道中，黄酮类在蔓荆子中主要有黄酮类、二氢黄酮类及其相应的苷类。已分离的黄酮类成分包括紫花牡荆素，3，6，7-三甲氧基槲皮万寿菊素1，木犀草素，Crys

11、osplenol、penduletin及(2S)-5,3-二羟基-6,7,4-三甲氧基二氢黄酮2,木犀草素-7-氧葡萄糖苷，异荭草素，牡荆素等黄酮类和二氢黄酮类化合物, 现代药理表明，蔓荆子中的黄酮类化合物是蔓荆子中的主要活性成分。1.1.2 酚类目前从蔓荆子中分离出来的酚类主要有4-hydroxybenzoic acid methyl ester, vanillic acid methyl ester, 4-hydroxy benzaldehyde, 4-hydroxybenzoic acid and ferulic acid, 3,4-二羟基苯甲酸3。1.1.3苯丙素类根据相关文献报道，已

12、从蔓荆子中分离出的苯丙素类化合物有vitrofolal A, vitrofolal B, vitrofolal C, vitrofolal D, dihydro-diconifery -lalc-b-D-(2-O-p-hydroxybenzoyl) glucoside, dihydro-diconifery-lalc -9-O-b-D-glucoside 等4。萜类、甾类化合物萜类化合物在蔓荆子中主要有二萜类和环烯醚萜类。二萜类化合物是蔓荆子主要的特征成分，至今已从该植物中分离得到多个此类化合物，其中主要为labdane型结构，亦有部分abitane型二萜。已分离得到的成分有蔓荆呋喃萜(rot

13、undifuran)和前蔓荆呋喃萜(prerotundifuran)，无羁萜(friedelin)、-谷甾醇、-谷甾醇-D-葡萄糖苷、-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷等。日本学者Ono M5等对蔓荆子进行了较深入的研究，已从蔓荆子中分离到数十个二萜类化合物，包括vitexifolin A，vitexifolin B，vitexifolin C，vitexifolin D，vitexifolin E，vitetrifolin D，trisnor -gamma-lactone，iso-ambreinolide等。1.1.5挥发油、氨基酸等其它成分蔓荆子及其叶中所含挥发油的主要成分为崁烯(camphene

14、)和蒎烯(pinene)6。同时，蔓荆子中还含有多种氨基酸。杨洁等对蔓荆子中各种氨基酸的含量进行了测定，结果测得风干蔓荆子中含18种氨基酸，其中有异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、撷氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸这八种人体必需氨基酸。此外，蔓荆子中亦含有维生素E以及Cu，Zn等无机元素7。1.2 黄酮类化合物的研究概况黄酮类化合物的分布 黄酮类化合物是一类低分子量的广泛分布于植物界的天然植物成分，为植物多酚类的代谢物，数量之多列天然酚性化合物之首，大多具有颜色。从植物系统学的角度，植物体产生黄酮的能力与植物体木质化性质密切相关。因此黄酮类化合物主要分布在维管束植物中，而在其它较低等的植物类群中

15、分布较少。而其中大多集中于被子植物中，如豆科、蔷薇科等。在这些植物中此类化合物的类型最全，结构最复杂，含量也最高。苔类中含有的黄酮类化合物为数不多，而藻类、微生物、细菌中没有发现黄酮类化合物的存在8。有文献记载约有20%的中草药中含有黄酮类化合物，可见其资源之丰富。黄酮类化合物的结构和分类以前，黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物，现在则是泛指两个苯环(A环与B环)通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物。天然的黄酮类化合物几乎在A、B环上均有取代基，一般是轻基、甲氧基和异戊烯基等。在植物体中，黄酮类化合物因其所在组织不同，其存在状态也呈多样化。在木质部多以昔元形式存在

16、;在花、叶、果实等器宫多以糖试形式存在。根据中央三碳链的氧化程度、B环连接位置(2-位或3-位)以及三碳链是否成环状等特点，可将黄酮类化合物分为黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类、黄烷醇类、花色素类、查耳酮类、二氢查耳酮类、双苯毗酮类、橙酮等。1.3黄酮类化合物的生理活性抗氧化及抗自由基作用 自由基性质活泼，有极强的氧化反应能力，对人体有很大的危害性，在体内自由基和脂质过氧化作用使多种大分子成分，如核酸、蛋白质产生氧化变性，DNA交联和断裂，导致细胞结构改变和功能破坏，而引起癌症、衰老及心血管等退变性疾病9。生物体内常见的自由基有超氧自由基(O2·-)

17、、羟自由基(·OH)、烷氧自由基（RO·)。黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化的能力，其作用机理在于它阻止了自由基在体内产生三个阶段:(l)与O2·-反应阻断自由基的引发连锁反应;(2)与金属离子鳌合阻断自由基生成;(3)与脂质过氧基(Roo·)反应阻断脂质过氧化过程。对心血管系统的作用.1对血压的影响 黄酮类化合物对高血压引起的头痛、项强、头晕、耳鸣等症状有明显的疗效，尤以缓解头痛、项强为显著。葛根素对正常和高血压动物都有一定的降压作用，静注葛根素能使正常麻醉犬的血压短暂而明显地降低，也能显著降低清醒自发性高血压大鼠(SHR)血压10。从桑根皮中分得的

18、Morucenin A、C及Kuwanon G、H在大白鼠及家兔身上有明显的降压作用11。.2抑制血小板的凝集 黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝血作用。实验表明不同浓度的黄酮类化合物可以不同程度地抑制二磷酸腺昔(ADP)诱导的大鼠血小板凝集，对5-轻色胺和ADP联合诱导的家免和绵羊血小板凝集也有同样的抑制作用12。此外黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞轻脯酸代谢，使内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治动脉粥样硬化。据报道，棚皮素等黄酮类化合物对由ADP、胶原或凝血酶引起的血小板聚集及血栓形成也有抑制作用。这与一些含有黄酮类成分

19、的活血化疲中草药的作用机制可能有某种程度的内在联系13。.3对外周血管的影响 静注黄酮类化合物于麻醉犬后，全部动物的脑血流量增加且血管阻力相应降低，还能使乙酞胆碱引起的脑内动脉扩张和去甲肾上腺素引起的收缩减弱，使处于异常状态下的血管功能恢复上常水平14。此外还可以改善异丙肾上腺素引起的小鼠微循环障碍，使毛细血管前小动脉管径增加，流速加快。 抗癌、防癌作用 黄酮类化合物具有较强的抗癌防癌作用，一般可通过以下三种途径:(l)对抗自由基;(2)直接抑制癌细胞生长;(3)对抗致癌促癌因子。陈晓莉等15用MTT快速测定法及流式细胞仪分析黄酮类化合物对靶细胞人肝癌SMMC-772的抗癌药效表明，此类物质有

20、较强的抗癌活性，与丝裂霉素(MMC)联合用药抗癌活性显著增强，流式细胞仪分析细胞分裂周期各时象DNA变化显示，此类物质使S期细胞明显减少，增殖指数降低，并诱导凋亡。据报道，牡荆素、汉黄答素等具有抑制肿瘤细胞的作用。 抗炎、抗菌、抗病毒作用 黄酮类化合物具有明显的消炎、抗溃疡作用。白凤梅等16研究表明天然黄酮对小鼠急性胃溃疡有明显的消退作用，肯定了高剂量的黄酮提取物(200mg/mL)能使胃粘液增加并且减轻胃的损伤。芦丁及其衍生物轻乙基芦丁、二氢棚皮素以及橙皮昔一甲基查耳酮(HMC)等据报道对角叉菜胶、5-HT及PEG诱发的大鼠足爪水肿、甲醛引起的关节炎及棉球肉芽肿等均有明显的抑制作用。黄酮类化

21、合物的抗炎作用可能与前列腺素(PEG)生物合成过程中的脂氧化酶受到抑制有关17。黄答试、黄答素、木犀草素具有抗菌作用。此外研究表明芦丁黄酮类化合物具有抗流感病毒、脊髓灰质炎病毒的感染和复制能力。 泻下作用 如中药营实中的营实昔A有致泻作用17。 降血糖作用 黄酮类化合物能够促使胰岛细胞的恢复，降低血糖和血清胆固醇，改善糖耐量，对抗肾上腺素的升血糖作用，并能抑制醛糖还原酶。1.4黄酮类化合物的开发与利用市场前景 随着食品工业的发展和消费水平的不断提高，人们越来越注重强身键体，改善饮食习惯，提高生活质量。于是保健食品以其天然性、实效性等特点在世界范围内成为人们追逐的目标。在众多的天然活性成分中黄酮

22、类化合物是极有应用潜力的资源之一。 黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得，而黄酮类化合物广泛存在于植物体中，因此近十多年来各国科学家都积极关注着从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分，并进一步加工成具有抗癌、抗衰老、调节内分泌等特异功能的保健食品和药品等产品。这些产品可调节人体生理功能，提高生命运动质量，为食用者带来健康体魄。目前黄酮类化合物一般可采取如下两种利用方式:(l)直接应用含黄酮的植物提取液制成保健品食品;(2)将含黄酮的植物提取液经浓缩、分离纯化、干燥等精制步骤，制取高纯度的黄酮类化合物。黄酮资源开发 黄酮类化合物可用于制备抗心血管病药物、抗肝脏毒药物、止咳平喘药、

23、天然抗氧化剂、无公害农药等。1.5 结语通过以上综述，我们可以看出国内外对蔓荆子的化学成分以及黄酮类化合物的药理作用进行了大量的研究工作，这为我们的进一步研究提供了方便。同时我们也可以看到蔓荆子黄酮类成分值得进一步研究，但由于蔓荆子药材的质量评价标准仍不够规范和先进，这严重影响了蔓荆子及其制剂的质量评价系统的建立和产品质量的提高。为了更好地开发利用该植物丰富的天然资源，建立规范、先进的蔓荆子质量评价体系，我们有必要深入进行化学成分及药理活性研究，为综合开发利用本植物提供理论依据。第二章 仪器与试剂2.1试剂与材料正丁醇 化学纯CP 国药集团化学试剂有限公司甲醇 分析纯AR 天津市福晨化学试剂厂

24、乙酸乙酯 分析纯AR 天津市福晨化学试剂厂三氯甲烷 分析纯AR 国药集团化学试剂有限公司石油醚（60-90） 分析纯AR 天津市富宇精细化工有限公司柱层析用聚酰胺（30-60，80-100目） 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂柱层析用硅胶（100-200 ，300-400目） 青岛海浪硅胶干燥剂厂蔓荆子总黄酮 湖南师范大学医学院天然药物化学教研室提供2.2仪器电子天平 JY2002 上海良平仪器仪表有限公司旋转蒸发仪R-1001N 郑州长城科工贸有限公司低温冷却液循环泵 郑州长盛实验仪器有限公司HH-S恒温水浴锅 江苏金坛县医疗仪器厂循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司ZF-2型三用紫外仪 上

25、海市安亭电子仪器厂202型电热恒温干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司第三章提取分离3.1预实验1) 取1g蔓荆子总黄酮样品于50ml圆底烧瓶中。2) 加入30ml氯仿，于75水浴加热回流提取1.5小时，过滤，回收滤液，再加入30ml氯仿加热回流提取1小时，过滤，收集滤液，合并两次滤液即得氯仿萃取液。3) 经氯仿萃取后的滤渣用同样的方法再分别依次用乙酸乙酯、正丁醇加热回流提取，收集滤液，分别得到乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液。4) 将三种萃取液经减压浓缩，干燥后得固体粉末，再分别称重，各部分重量依次为0.19g、0.06g、0.11g，最后残留的固体粉末为0.05g。5) 对三种提取物做TLC检识，

26、用氯仿和乙酸乙酯以合理的比例作展开剂，经试验探索，当氯仿与乙酸乙酯比例为10:2时，氯仿提取部分中各成分分离效果较好，在紫外灯下观察有四个以上的明显斑点，并在Rf值小于0.17的范围内有拖尾现象，而其他两部分中各成分未能分离。总结：由于经氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分别提取得到的固体重量比例为4:2:1，氯仿提取物所占比重最大，且用氯仿和乙酸乙酯为展开剂做TLC检识时，氯仿提取物分离效果较好，因考虑到实验的完成期限，故本实验仅对氯仿提取部分各成分进行研究。3.2总黄酮主要成分的提取分离提取分离流程图图3.1提取分离流程图3.2.2TLC试验探索洗脱体系经实验探索，发现当使用氯仿-乙酸乙酯（10:0.

27、8）洗脱系统时样品中各成分分离效果最佳。3.3 硅胶柱层析分离1) 拌样：将棕色固体29g进行硅胶柱层析，先将固体溶于氯仿中，再加入100-200目的硅胶50g搅拌均匀，减压回收溶剂，取出样品，自然挥干残留溶剂。2) 装柱： 将300g硅胶（300-400目）用氯仿湿法装柱（柱子直径=7.5cm，H=120cm），待沉降完全后，测得硅胶的高度为20cm，上样后样品硅胶高度为5cm。3) 洗脱：用氯仿:乙酸乙酯=10:0.8的混合洗脱液洗柱，收集各流分。但从开始加入洗脱液后流速越来越慢，后完全停滞，以致最后不出流分流分收集失败。分析原因：可能是由于室温过低，样品在氯仿-乙酸乙酯系统中溶解度较低而

28、导致结晶析出，化合物的结晶形成坚固的实体,溶剂不易把结晶层渗透,故柱子几乎不会有溶剂滴出（柱口处有结晶）。4) 回收样品：将流动相，上样硅胶，装柱硅胶取出，用甲醇提取回收样品，干燥后称重，得棕色固体25g。3.4聚酰胺柱层析分离1) 拌样：将棕色固体25g进行聚酰胺柱层析，先将固体溶于氯仿中，加入30-60目聚酰胺40g搅拌均匀，减压回收溶剂，取出样品，自然挥干残留溶剂。2) 装住：将80-100目聚酰胺300g用乙酸乙酯湿法装柱，待沉降完全后，聚酰胺高度为20cm，上样样品高度为5cm。3) 洗脱-浓缩：依次用乙酸乙酯：甲醇=20:1、18:1梯度洗脱柱子，共接流分11分，每份50-100m

29、l，最后用甲醇洗脱。4) TLC检识（氯仿:乙酸乙酯=10:0.8）：合并相同流分，1-4、5-6、7、 8、9、10、11，发现流分1-4在紫外灯下斑点明显且清晰，同时由于时间关系，因此先对流分1-4（极性较小）进行下一步分离。3.5 硅胶柱层析分离流分1-41) 探索洗脱系统及洗脱剂的比例： 当石油醚:乙酸乙酯=5:4时，各成分分离效果较好，故选择石油醚-乙酸乙酯溶剂系统比例为5:4。2) 称样，拌样： 样品量为5.5g，用硅胶（100-200目）10g加乙酸乙酯拌样，减压回收溶剂，取出样品，自然挥干残留溶剂。3) 上柱：分两根柱子上柱（因没有合适大小的柱子，故选择两个柱子同时上柱）a.

30、=3cm的柱子，取60g硅胶（300-400目）用石油醚湿法上柱，待沉降完全后高度为30.5cm，取10g已拌样品加入，高度为3.5cm，开始用洗脱液洗柱，接流分，每管15-25ml。b. =2.5cm的柱子，取45g硅胶（300-400目）用石油醚湿法上柱，待沉降完全后高度为32cm，将剩下的已拌样品加入，高度为3.7cm，开始用洗脱液洗脱，接流分，每管15-25ml。4) TLC检识：=3cm的柱子共接流分51份，经TLC检识（ 展开剂为石油醚:乙酸乙酯=5:4 ），合并的相同流分为1-5、6-9、10-12、13-16、20-22、23-30、31-32、33-41、42-51； 部分T

31、LC检识结果如图： 展开剂 石油醚：乙酸乙酯（5:4）图3.2流分（1-6）、（7-9）、（10-12）、（13-16）、17-23 图3.3流分23-35图3.4流分35-50=2.5cm的柱子共接流分28份，经TLC检识合并的相同流分为5-7、8-9、10-12、13-16、18-23、24-28。部分TLC检识结果如图：展开剂 石油醚：乙酸乙酯（5:4）图3.5流分1-13 图3.6流分13-26展开剂石油醚：乙酸乙酯(4:6）图3.7流分（18-23）、(24-28)、29-395) 经TLC检识，可将23-30（=3cm）与13-16 （=2.5cm）、33-41（=3cm）与18-

32、23 （=2.5cm）、42-51（=3cm）与24-28 （=2.5cm）合并，然后减压浓缩。6) 将两根柱子继续洗脱，接流分52-64（=3cm）、29-39（=2.5cm）7) 做TLC检识，将相同流分合并，分别为52-53、54-64（=3cm）和30-39（=2.5cm），然后减压浓缩。层析分离流程图如下：a. =3cm的柱子；b.=2.5cm的柱子图3.8=3cm的柱子图3.9=2.5cm的柱子第四章 结果与讨论本实验采用氯仿加热提取，通过聚酰胺柱粗分离，将蔓荆子总黄酮中不同极性的化合物分离开并富集，再使用硅胶柱对分离得到的物质进行进一步的细分，由于时间的关系，本实验先选择极性较小

33、的部分化合物（聚酰胺柱流分1-4）进行分离。将流分42-51（=3cm）与24-28 （=2.5cm）合并，减压浓缩后，自然挥干溶剂，得到一绿色物质，总重为220mg，经TLC检识，为单一物质。TLC检识结果如图所示 （展开剂石油醚：乙酸乙酯=1:3，Rf值为0.53）图3.10TLC检识结果图此外，图3.本次试验还得到了12个混合组分，由于时间的关系没能继续下一步的分离工作，这些混合组分大部分可以继续进行柱层析分离，得到单体。所以本试验也为以后的工作提供了方便，同时打下了坚实的基础。参考文献1曾宪仪、方乍浦等.蔓荆子化学成分研究 J .中国中药杂志，1996，21(3):16.72徐诺译.蔓

34、荆子(单叶蔓荆)中舒张血管的药理活性成分研究 J .国外医学中医中药分册，1999，21(5):413Takeo Yoshioka, Tomohisa Inokuchi, Shozo Fujioka, et al. Phenolic Compounds and Flavonoids as Plant Growth Regulators from Fruit and Leafof Vitex rotundifolia. Z.Naturforsch.2004,59c:509-5144 Qiong Gu, Xue-Mei Zhang, Jun Zhou, et al. One new dihydrobenzofuran lignan from Vitex trifoliaJ. Journal of Asian Natural Products Research,20