树脂型PCR产物纯化及胶回收试剂盒操作方法

1、树脂型 PCR 产物纯化及胶回收试剂盒操作方法一从反响液中回收 PCR产物1将0.4ml纯化树脂使用前充分混匀与50100卩l无石蜡油的PCR反响液 颠倒混匀 3 分钟。然后装入离心纯化柱， 13,000rpm 离心 30 秒，倒掉收集管 中的废液。2. 参加500卩l 80瞬丙醇或乙醇，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废 液。重复第 2步一次，此步骤 13,000rpm 离心 2分钟，务必将异丙醇或乙醇 除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇或乙醇，13,000rpm再离心1分 钟。3. 将离心纯化柱套入干净的 1.5ml 或 2ml 离心管中，开盖放置 23分钟，使残 留的乙醇充

2、分挥发干净。参加50卩l TE缓冲液假设用于测序，那么加50 1超纯 水于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13,000rpm离心30秒。 TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心柱放入离心管中， 假设盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。4. 离心管中的液体即是纯化的 PCF产物，取4卩1电泳0.8%琼脂糖，120V, 10 分钟检测并目测定量。-20 C保存备用。二从普通琼脂糖凝胶中回收 DNA片段1将无石蜡油的PCR反响液或酶切反响液50卩l100卩l反响体系在1%勺普 通琼脂糖凝胶上电泳，切下所需的 DNA条带装入2ml离心管中。尽量切掉不含DNA勺琼脂糖凝胶，这样可

3、简化操作、提高回收量及DNA片段的质量。2. 200mg400m琼脂糖凝胶中参加0.4ml纯化树脂使用前充分混匀，70C保 温 510 分钟，每两分钟颠倒混匀 1 次，使琼脂糖凝胶完全融化。对于高浓度的琼脂糖凝胶2%，每200mg的琼脂糖凝胶中参加0.5ml纯化 树脂，加热融胶的时间延长到 15分钟。3将混和液转移入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。4. 参加500卩I 80瞬丙醇或乙醇，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废 液。重复第4步一次，此步骤13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇或乙醇 除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇或乙醇，13,000

4、rpm再离心1分 钟。5. 将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，开盖放置23分钟，务必 使乙醇充分挥发干净，参加40卩I TE缓冲液假设用于测序，那么加40卩1超纯水 于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置 2分钟后，13,000rpm离心30秒。TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心柱放入离心管中， 假设盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。6. 离心管中的液体即是纯化的 DNA片段，取4卩1电泳0.8%琼脂糖，120V, 10 分钟检测并目测定量。-20 C保存备用。常见问题及参考意见常见问题可能原因参考意见回收率低琼脂糖胶块未完全融化尽量切掉不含DNA勺琼脂糖凝胶4

5、00卩I的纯化树脂中不要超过400mg® 脂糖凝胶增加温育时间至15分钟，每2分钟混匀 一次琼脂糖凝胶浓度过高配制0.8%1.0%勺琼脂糖凝胶进行回收某些琼脂糖凝胶不容易被融化更换琼脂糖，情况可能会变好纯化树脂于GS结合液中有 结晶出现将纯化树脂于GS结合液中置于37C 温浴30min以上，使结晶完全溶解，且在 使用前要充分混匀洗脱温度过低参加无菌超纯水或TE浸透树脂后，于37 T温育2分钟回收片段过大或过小最适宜的回收片段为200bp5Kb回收的DNA片 段在后续实 验中出现问 题例如连接 失败盐的浓度过高用80%L醇漂洗回收产物增加漂洗次数残留有有机试剂增加离心时间，将80%醇或异丙醇去 除干净EB染色须在紫外线下切胶，紫 外线的照射损伤了 DNA片段在长波紫外线下切胶尽量缩短切胶时间建议用其它 DNA染料代替EB 例如GoodView?染料，在自然光下切胶在胶里和电泳缓冲液中参加 DNA紫外防 护剂局部双链DNA变性为单链DNA在进行后续酶反响时，参加除酶以外的 其它成份，通过95C 2分钟，再缓慢冷 却至室温25E以下，使单链DNA重新 退火为双链DNA然后参加酶，继续进 行酶反响用含有10mM NaC的Tri