实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用

1、2013-11-26实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术的原理及应用的原理及应用（Real Time Quantitative PCR） Contents一、实时一、实时荧光定量荧光定量PCRPCR的定义的定义二、二、RT-PCRRT-PCR技术的技术的原理及试验流程原理及试验流程三、三、RT-PCRRT-PCR技术的数据分析技术的数据分析四、四、RT-PCRRT-PCR技术的应用技术的应用实时荧光定量实时荧光定量PCR目录目录PCR电泳实时荧光定量实时荧光定量PCR的定义的定义普通PCR在在PCRPCR结束后对结束后对 进行定量分析进行定量分析终点产物终点产物 PCRPCR技术技术和和荧光

2、检测技术荧光检测技术的结合的结合通过通过荧光染料荧光染料或或荧光标记的特异性探针荧光标记的特异性探针，对，对PCRPCR产物进行产物进行标记跟踪，标记跟踪，实时在线监控实时在线监控反应过程反应过程，通过仪器和相应的，通过仪器和相应的软软件件分析结果分析结果，对待，对待测样品的测样品的初始模板进行定量初始模板进行定量或定性分析或定性分析。 克服了普通克服了普通PCRPCR：1 1、终点定量重复性不好、终点定量重复性不好 2 2、EBEB有毒，荧光太贵等缺点有毒，荧光太贵等缺点实时荧光定量实时荧光定量PCR的定义的定义PCRPCR技术技术和和荧光检测技术荧光检测技术的结合的结合通过通过荧光染料荧光

3、染料或或荧光标记的特异性探针荧光标记的特异性探针，对，对PCRPCR产物进行产物进行标记跟踪，标记跟踪，实时在线监控实时在线监控反应过程反应过程，通过仪器和相应的，通过仪器和相应的软软件件分析结果分析结果，对待，对待测样品的测样品的初始模板进行定量初始模板进行定量或定性分析或定性分析。实时荧光定量实时荧光定量PCR的定义的定义RT-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及试验流程RT-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及试验流程RT-PCR反应体系模板4.5lTag mixture5.0lF(F)0.25lR(R)0.25l荧光染料 SYBR Green I荧光标记的探针TaqMan探针法RT

4、-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及试验流程Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）法）变性变性退火退火延伸延伸RT-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及试验流程SYBR Green法优缺点法优缺点RT-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及试验流程RT-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及试验流程Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）法）RT-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及试验流程TaqMan法法TaqMan探针法优缺点探针法优缺点RT-PCR技术的原理及试验流程技术的原理及

5、试验流程n绝对定量绝对定量(Absolute Quantification(Absolute Quantification，AQ)AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究n相对定量相对定量(Relative Quantification(Relative Quantification，RQ)RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析相对定量通过内标定量相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析内标内标（Endogenous ControlEndogenous Cont

6、rol）通常是18S、28S、-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小PCRPCR分四个阶段分四个阶段RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析-CtPCR扩增循环数扣除背景荧光后的相对荧光量1. 1. 荧光荧光域值（域值（thresholdthreshold）的）的设定设定在定量在定量PCRPCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以被检测到，一般以1515个循环的荧光信号作为荧光本底个循环的荧光信号作为荧光本底信号。信号。RT-PCR技术的技术的数

7、据分析数据分析-CtPCR扩增循环数扣除背景荧光后的相对荧光量2. 2. Ct Ct 值的定义值的定义 在在荧光定量荧光定量PCRPCR技术中，有一个很重要的概念技术中，有一个很重要的概念 Ct Ct值。值。C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt值的含义是：值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如循环数（如图所图所示）。示）。RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析-Ct3. Ct3. Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系研究表明，每个模板的研究表明，每个模板

8、的CtCt值与该模板的起始拷贝数的对数存值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，在线性关系，起始拷贝数越多，CtCt值越小。利用已知起始拷贝值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代数，纵坐标代CtCt值。因此，只要获得未知样品的值。因此，只要获得未知样品的CtCt值，即可从值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 PCR扩增循环数扣除背景荧光后的相对荧光量RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析3. Ct3. Ct值与起始模板的关系

9、值与起始模板的关系研究表明，每个模板的研究表明，每个模板的CtCt值与该模板的起始拷贝数的对数存值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，在线性关系，起始拷贝数越多，CtCt值越小。利用已知起始拷贝值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代数，纵坐标代CtCt值。因此，只要获得未知样品的值。因此，只要获得未知样品的CtCt值，即可从值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析相对定量分析方法相对定量

10、分析方法 -Ct前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏差在 5以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值： CT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) CT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control) 2、用试验样本的CT值减校准样本的CT值： CT= CT（test/control) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 CTRT-PCR技术的技术的数据分析数据分析SYBR Green 熔解曲线分析熔解曲线分析RT-PCR技术的技术的数据分析数据分析 临床疾病诊断临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。 动物疾病检测动物疾病检测：禽