现代仪器分析色谱分析法3

1、以下进行分析。固定液用量一般为15-25。大多数情况下，采用固体吸附剂作为固定相。要求担体粒度均匀、细小，但粒度过细阻力过大，使柱前压增大，对操作不利。一般使用6080目的担体比较适宜。3、固定液的性质及用量：气相色谱使用的固定液可见上一节，原则上来讲，所有气相色谱使用的固定液均可用于液相色谱分析中。在液相色谱法中将固定相分为以下几类：全多孔型担体： 高效液相色谱法早期使用的担体与气相色谱法相类似，是颗粒均匀的多孔球体，例如由氧化硅、氧化铝、硅藻土制成的直径为100m左右的全多孔型担体。由于分子在液相中的扩散系数要比气相中小45个数量级，所以填料的不规则性和较宽的粒度范围所形成的填充不均匀性成

2、为色谱峰扩展的一个明显原因。另外，由于孔径分布不一，并存在“裂隙”，在颗粒深孔中形成滞留液体(液坑)，溶质分子在深孔中扩散和传质缓慢，这样就进一步促使色谱峰变宽。 为了克服上述缺点，应降低填料的颗粒，并从装柱技术上改进，使之能装填出均匀的色谱柱，这样就能达到很高的柱效。20世纪70年代初期出现了小于10m直径的全多孔型担体，它是由nm级的硅胶微粒堆聚而成为5m或稍大的全多孔小球。由于其颗粒小，传质距离短，因此柱效高，柱容量也不小。 表层多孔型担体 （又称薄壳型微珠担体）：它是直径为3040m的实心核(玻璃微珠)，表层上附有一层厚度约为12m的多孔表面(多孔硅胶)。由于固定相仅是表面很薄一层，因

3、此传质速度快，加上是直径很小的均匀球体，装填容易，重现性较好，因此在20世纪70年代前期得到较广泛使用。但是由于比表面积较小，因此试样容量低，需要配用较高灵敏度的检测器。随着近年来对全多孔微粒担体的深入研究和装柱技术的发展，目前粒度为510m的全多孔微粒担体是使用最广泛的高效填料。 从原则上讲，气相色谱用的固定液，只要不和流动相互溶，就可用作液液色谱固定液。但考虑到在液液色谱中流动相也影响分离，故在液液色谱中常用的固定液只有极性不同的几种，如强极性的，氧二丙腈，中等极性的聚乙二醇400和非极性的角鲨烷等。化学键合固定相 ： 将固定液机械地涂附在担体上以组成固定相会出现许多不良后果，如在色谱分离

4、过程中,固定液在流动相中有微量溶解，流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液会不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果。为了更好地解决固定液从载体上流失的问题，将各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶(担体)表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相，为色谱分离开辟了广阔的前景。20世纪60年代后期发展了一种新型的固定相化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面(具有Si-OH基团)的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型(Si-O-C)；硅氧硅碳键型(Si-O-Si-C)；硅碳键型(Si-C)和硅氮键

5、型(Si-N)四种类型。例如在硅胶表面利用硅烷化反应制得Si-O-Si-C键型(18烷基键合相)的反应为：在上述类型中使用最为广泛的为三SiOSiRC型，因为它的化学键稳定，耐水、耐热、耐有机溶剂，是液相色谱应用广泛的固定相。 化学键合固定相具有如下一些特点。· 表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多； 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析(表27)； d有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。 由于存在着键合基团覆盖率问题，化学键合固定相的分离机制既不是全部吸附过程，亦不是典型的液液分配过

6、程，而是双重机制兼而有之，只是按键合量的多少而各有侧重。液固吸附色谱法固定相 液固吸附色谱法采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，目前较常使用的是510m的硅胶微粒(全多孔型)。 离子交换色谱法固定相 通常有两种类型：薄膜型离子交换树脂 常用的为薄壳型离子交换树脂，即以薄壳玻珠为担体，在它的表面涂约1的离子交换树脂而成。离子交换键合固定相 用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。它也分为两种形式。一种是键合薄壳型，担体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒担体型离子交换树脂，它的担体是微粒硅胶。后者是近年来出现的新型离子交换树脂。它具有键合薄壳型离子交换树脂的优表27化学键合固定相的类型及应

7、用试样种类键合基团流动相色谱类型实 例低极性溶解于烃类C18甲醇水乙腈水乙腈四氢呋喃反相多环芳烃甘油三酯、类脂、脂溶性维生素、甾族化合物、氢醌中等极性可溶于醇CNNH2乙腈、正己烷氯仿正已烷异丙醇正相脂溶性维生素、甾族、芳香醇、胺、类脂止痛药芳香胺、脂、氯化农药、苯二甲酸C18C8CN甲醇、水乙腈反相甾族，可溶于醇的天然产物、维生素、芳香酸、黄嘌呤高极性可溶于水C8CN甲醇、乙腈、水、缓冲溶液反相水溶性维生素、胺、芳醇、抗生素、止痛药C18水、甲醇、乙腈反相离子对酸、磺酸类染料、儿茶酚胺SO3水和缓冲溶液阳离子交换无机阳离子、氨基酸NR3+磷酸缓冲液阴离子交换核苷酸、糖、无机阴离子、有机酸点，

8、室温下即可分离，柱效高，且试样容量较前者大。 上述两类离子交换树脂，又可分为阳离子及阴离子交换树脂。按离子交换功能团酸碱性的强弱，阳离子交换树脂又分为强酸性与弱酸性树脂；阴离子交换树脂也分为强碱性及弱碱性树脂。由于强酸或强碱性离子交换树脂比较稳定，pH适用范围较宽，因此在高效液相色谱中应用较多。排阻色谱法固定相 常用的排阻色谱固定相分为软质、半硬质和硬质凝胶三种。所谓凝胶，是含有大量液体(一般是水)的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。软质凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相。葡聚糖凝胶也称交联葡聚糖凝胶，是由葡聚糖(右旋糖酐)和甘油基通过醚桥(一O-

9、CH2一CHOH-CH2-O-)相交联而成的多孔状网状结构，在水中可膨胀成凝胶粒子。葡聚糖凝胶孔径的大小，可由制备时添加不同比例的交联剂来控制，交联度大的孔隙小，吸水少，膨胀也少，适用于小相对分子质量物质的分离。交联度小的孔隙大，吸水膨胀的程度也大，适用于大相对分子质量物质的分离。软质凝胶在压强1 kg·cm2左右即压坏，因此这类凝胶只能用于常压排阻色谱法。半硬质凝胶 如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶(交联聚苯乙烯凝胶)是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂，不能用于丙酮，乙醇一类极性溶剂，同时，由于不同溶剂其溶胀因子各不相同，因此不能随意更换溶剂。能耐较高压力，流速不宜大。硬质凝

10、胶 如多孔硅胶、多孔玻珠等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶，它的特点是化学稳定性、热稳定性，机械强度好，可在柱中直接更换溶剂，缺点是吸附问题，需要进行特殊的处理。可控孔径玻璃珠是近年来受到重视的一种固定相。它具有恒定的孔径和较窄的粒度分布，因此色谱柱易于填充均匀，对流动相溶剂体系(水或非水溶剂)、压力、流速、pH或离子强度等都影响较小，适用于较高流速下操作。 在选择柱填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限(即无法渗透而被排阻的相对分子质量极限)。每种商品填料都给出了它的相对分子质量排阻极限值，可以参考有关资料。4、担体的性质和粒度气相色谱柱：6080目或80100目（100目约等于150微米）液相

11、色谱柱：2050微米5、进样时间、进样量及进样方式进样速度必须很快，使样品立即汽化并被带入色谱柱中。否则若进样时间过长，样品原始宽度变大，则馏出峰宽必也变宽甚至峰变形。原则上要求在选择的汽化室温度下样品能瞬间汽化而不分解。这对高沸点或易分解组分尤为重要。由于色谱进样量为微升级近于无限稀释的情况（相当于减压），故汽化温度可比样品最难汽化组分的沸点略低些；反之，进样量多汽化温度就要高些。一般选择比柱温高约50100摄氏度。样品汽化不良将使峰形前沿平坦后沿陡峭成伸舌形，同时峰的半峰宽变大。进样量太小时，会影响检出和增大误差；可是，若进样太大，组分不呈无限稀释的气体或溶液状态，则柱效下降，半峰宽将随着

12、进样量的变化而变化。同时由于柱超负荷使分离效果差和拖延馏出时间。6、气相色谱法的取样和进样（1）液体进样：液体一般采用微量注射器进样。常用的微量进样器有1l . 5l. 10l.50l等规格。微量进样器很精密，要小心使用。尤其注意不要将进样器（1l.5l）的芯子全部拔出来，若不慎拉出，再不了解微量进样器结构之前，不要用手推进，否则会损坏进样器。此时应报告有关人员设法维修。微量进样器主要有两种类型：一种是无存液进样器（1l、5l）。另一种是有存液进样器（10l、50l），此种进样器可以把芯子拉出来清洗。在进样时针头要存有一部分液体。具体取样方法按下述步骤进行：a.轻摇样品瓶，取干净的进样器把栓杆

13、推到底部，将针头伸到液层中部。b.向上缓慢拉动栓杆。吸取样品。将针内样品打入废液瓶中。如此反复23次，以清洗针管。c.抽取试样要比所需要的样品多5-10 。d.推动栓杆排去过量的液体，使栓杆的顶部停留在所需要进样量的刻度上。e.把栓杆的顶部放在眼前，与视线一平，读取刻度。以排除视差，并注意以刻度上的上边为读数标准，与此同时，再观察针管中的液体样，应该清亮和无气泡。f.用手弹去针头外部的液体。或用滤纸快速擦去针外液体，但要注意不能让滤纸接触针尖，以免将针内液体吸出，不能用手直接接触针头，以防热量传到针头上。g.右手持针管，左手协助，迅速把针头刺进进样器口，深度为5cm左右，同时向里迅速推进栓杆。

14、推到底部后立刻拔出针头。h.注意在使用微量进样器时推的方向要正，要迅速，用力适当，又快又轻。从针尖接触到进样口到针拔出的时间应不超过一秒钟。（2）气体进样：气体进样常用旋转式六通阀进样，通过定量管取样。常用定量管有1.3.5.10毫升等规格。六通阀的工作原理及结构见18.5.2进样系统装置（3）进样量：填充柱中液体进样量0.55微升，气体进样0.25毫升。毛细管柱的液体进样为1-2微升，但实际进样由分流比控制，一般将分流比设计为30-100为宜，也可根据色谱分离结果进行调节（分流比调节范围20500）。一般要求12秒内完成色谱的进样，气相色谱进样量 0.55微升，采取直接进样方式；液相色谱进样

15、量510微升，采取六通阀进样方式（常用于气体进样和高压液相色谱仪的进样）。工作原理如下图：7、汽化室和检测器的温度选择（应高于柱温50度左右）§27色谱检测器§271气相色谱检测器在气相色谱分析中，样品组分经色谱柱分离后必须通过检定器将各组分按其物理的或化学的特性用直接或间接的办法显示来，才能辨别出各个组分及其浓度的变化情况，从而达到定性和定量的目的。可见，检定器也是色谱仪的一个重要部件。根据检测原理的不同，检测器又可分为浓度型检定器和质量型检定器两种。浓度型检定器包括热导池、电子捕获等检定器；质量型检定器包括氢焰离子化、火焰光度、碱金属离子化等检定器。浓度型检测器：测量的

16、是载气中某组分浓度瞬间的变化，即检测器的响应值和组分的浓度成正比。质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测器响应值和单位时间内进入检测器的某组分的质量成正比。在分析中要求检测器是响应快、灵敏度高、稳定性好、线性范围宽。并以这些作为衡量检测器质量的指标。所以在这一节首先介绍检测器的主要技术指标。1、灵敏度S检测器的灵敏度是指一定量的物质通过检测器时所给出的信号大小，称该检测器对该物质的响应值，也叫灵敏度，用S表示。如果信号以峰面积表示，则物质i的响应值Si为： （233）式中为物质i的峰面积；为物质i的进样量。如果以进样量Q对检测器响应值R作图就可得到一直线，如图177所示

17、。实际上检测器的灵敏度是响应信号对进样量的变化率，可以用式（1734）表示。 （234）图212 检测器响应值与进样量的关系图中直线的斜率就是检测器的灵敏度，QL为最大进样量，超过此量时进样量与响应值不呈线性关系。由于各种检测器作用机理不同，灵敏度得计算公式和量纲也就不同。对于浓度型检测器来说，其响应值正比于载气中组分的浓度，即，故可写作： （235）式中为比例常数，即检测器的灵敏度，下标c表示浓度型。由式（1735）得：= （236）式（1736）是实际测定浓度型检测器灵敏度得计算公式。其中R（峰高h）的单位为mV；V是进入检测器的载气体积，根据流速定义：可将V用表示，即载气流速（单位为mL

18、/min）乘以该组分的保留时间（单位为min）；m进入检测器的组分质量（被分析物质是液体时，单位为mg；被分析物质是气体时，单位为mL）。所以最终单位有不同的表示方式。对于浓度型检测器来说，如果样品是液体，采用式（1736）计算灵敏度得到的单位为，表示每一毫升载气中有一毫克试样时在检测器中所能产生的响应信号是多少毫伏；如果样品是气体，采用式（1736）计算灵敏度得到的单位为。对于质量型检测器来说，其响应值取决于单位时间内进入检测器某组分的量。浓度型和质量型检测器所以有这样的差别，主要是由于前者对载气有响应，而后者对载气没有响应的缘故。因此 （2-37）式中R（峰高h）的单位为mV；组分的保留时

19、间单位为s；组分进入检测器的质量单位为g。所以质量型检测器灵敏度的单位为。表示在一秒中内，一克样品进入检测器所产生的电信号的毫伏数。2、检出限D检出限也称敏感度，是指检测器恰能产生和三倍的噪声相同信号时，在单位体积或时间需要向检测器进入的物质质量（单位为g）。一般来说，D值越小，说明仪器越敏感。计算公式为：D= （2-38）式中S表示灵敏度；N表示检测器的噪声；D的最终单位为g/s3、最小检出量指检测器恰能产生三倍噪声所需进入色谱柱的最小物质量（或最小浓度）与检测器的检出限成正比；但与检出限不同，不仅检测器的性能有关，还与柱效率及操作条件有关。所得色谱峰的半峰宽越窄，越小。如果以时间表示Wh/

20、2，则对于浓度型检测器来说，其最小检出量的计算公式为（17-39）： （2-39）而对质量型检测器来说，其最小检出量的计算公式为（17-40）： （2-40）4、响应时间要求检测器能迅速和真实地反映通过它的物质的浓度变化情况，即要求响应速度快。为此，检测器的死体积要小，电路系统的滞后现象尽可能小，一般都小于1秒。5、线性范围这是指试样量与信号之间保持线性关系的范围，用最大进样量与最小检出量的比值来表示，这个范围越大，越有利于准确定量。、热导池检测器（TCD）热导池检测器，常用TCD表示。由于结构简单，灵敏度适宜，稳定性较好，而且对所有物质都有响应，因此是应用最广、最成熟的一种检测器。、热导池的

21、结构 热导池由池体和热敏元件构成，又可分双臂热导池和四臂热导池两种，参阅图213(a)和(b)。图213热导池示意图 热导池体用不锈钢块制成，有两个大小相同、形状完全对称的孔道，每个孔里固定一根金属丝(如钨丝，铂丝)，两根金属丝长短、粗细、电阻值都一样，此金属丝称为热敏元件。为了提高检测器的灵敏度，一般选用电阻串高，电阻温度系数(即温度每变化1，导体电阻的变化值)大的金属丝或半导体热敏电阻作热导池的热敏元件。钨丝具有较高的电阻温度系数和电阻率，而且价廉，容易加工，因此是目前最广泛使用的热敏元件。钨丝的主要缺点是高温时容易氧化。为克服钨丝的氧化问题，可采用铼钨合金制成的热丝，铼钨丝抗氧化性好，机

22、械强度、化学稳定性及灵敏度都比钨丝高。热导池有两根钨丝(采用220V，40W白炽灯钨丝)的是双臂热导池，其中一臂是参比池，一臂是测量池；有四根钨丝<采用220V，5W白炽灯钨丝)的是四臂热导池；其中两臂是参比池，两臂是测量池。 热导池体两端有气体进口和出口，参比池仅通过载气气流，从色谱柱出来的组分由载气携带进入测量池。、热导池检测器的基本原理 当电流通过钨丝时，钨丝被加热到一定温度，钨丝的电阻就增加到一定值（一般金属丝的电阻值随温度升高而增加）。在未进样时，通过热导池两个池孔(参比池和测量池)的都是载气。由于载气的热传导作用，使钨丝的温度下降，电阻减小，此时热导池的两个池孔中钨丝温度下降

23、和电阻减小的数值是相同的。在试样组分进入以后，载气流经参比池，而载气带着试样组分流经测量池，由于被测组分与载气组成的混合气体的热导系数和载气的热导系数不同，因而测量池中钨丝的散热情况就发生变化，使两个池孔中的两根钨丝的电阻值之间有了差异。此差异可以利用电桥测量出来。气相色谱仪中的桥路，如图214所示。图214 气相色谱仪中热导池检测器的桥路 · 图214中，R1和R2分别为参比池和测量池的钨丝的电阻，分别连于电桥中作为两臂。在安装仪器时，要挑选配对的钨丝，使R1=R2。从物理学中知道，电桥平衡时，Rl·R4 = R2·R3当电流通过热导池中两臂的钨丝时，钨丝加热到

24、一定温度，钨丝的电阻值也增加到一定值，两个池中电阻增加的程度相同。如果用氢气作载气，当载气经过参比池和测量池时，由于氢气的热导系数较大，被氢气传走的热量也较多，钨丝温度就迅速下降，电阻减小。在载气流速恒定时，在两只池中的钨丝温度下降和电阻值的减小程度是相同的，亦即Rl=R2，因此当两个池都通过载气时，电桥处于平衡状态，能满足，此时C，D两端的电位相等，E=0，就没有信号输出，电位差计记录的是一条零位直线，称为基线。如果从进样器注入试样，经色谱柱分离后，由载气先后带人测量池。此时由于被测组分与载气组成的二元导热系数与纯载气不同，使测量池中钨丝散热情况发生变化，导致测量池中钨丝温度和电阻值的改变，

25、而与只通过纯载气的参比池内的钨丝的电阻值之间有了差异，这样电桥就不平衡，即 RlR2这时电桥C，D之间产生不平衡电位差，就有信号输出。载气中被测组分的浓度愈大，测量池钨丝的电阻值改变亦愈显著，因此检测器所产后的响应信号，在一定条件下与载气中组分的浓度存在定量关系。电桥上C，D间不平衡电位差用一自动平衡电位差计记录其响应电位，在记录纸上即可记录出各组分的色谱峰。 W，W2，W，为三个电位器。当调节W：或W2时，都要影响电桥一臂的电位值，也就是影响电桥输出信号，因此Wl，W2都可用来调节桥路平衡，其中W1为零点调节粗调，W2为零点调节细调。在进样前，先调节Wl，W：，使记录器基线处在一定位置。W3

26、用来调节桥路工作电流的大小。C，D之间的一串电阻是衰减电阻，用以调节输入记录器电位信号的大小，使得到大小合适的色谱峰。、影响热导池检测器灵敏度的因素根据理论推导，对双臂热丝热导池产生信号大小的影响因素可用下式（2-41）表示： （2-41）这是一个简化的式子。S为热丝热导池响应值；K为常数；Mi为组分i的分子量；R、I各为热丝的电阻和通过的电流；n为固定电阻与热丝阻值之比，：为热丝的电阻温度系数；和：各为载气和组分i的热导系数；，称热导池结构因子，L为热丝长度，dl为热丝半径，d2为池孔内径。 了解影响检测器灵敏度的因素，主要是为了提高检测器的灵敏度和稳定性，其次，也要考虑便于操作和使用寿命等

27、问题。式（2-41）对于指导实践，正确选择操作条件，有重要的指导意义。 a、桥路工作电流的影响 电流增加，使钨丝温度提高，钨丝和热导池体的温差加大，气体就容易将热量传出去，灵敏度就提高。一般工作电流与响应值之间有三次方的关系（），即增加电流能使灵敏度迅速增加；但电流太大，将使钨丝处于灼热状态，引起基线不稳，呈不规则抖动，甚至会将钨丝烧坏。一般桥路电流控制在l00200mA左右（氮气作载气时为100150mA，氢气作载气时为150200mA）。b、热导池体温度的影响 当桥路电流一定时，钨丝温度一定。如果池体温度低，池体和钨丝的温差就大，能使灵敏度提高。但池体温度不能太低，否则被测组分将在检测器内冷凝。一般池体温度不应低于柱温。 c、载气的影响 载气与试样的热导系数相差愈大，则灵敏度愈高。由于一般物质的热导系数都比较小，故选择热导系数大的气体(例如H2 He)作载气，灵敏度就比较高。另外，载气的热导系数大，在相同的桥路电流下，热丝温度较低，桥路电流就可升高，从而使热导池的灵敏度大为提高，因此通常采用氢作载气。如果用氮作载气，除了由于氮和被测组分热导系数差别小，灵敏度低以外，还常常由于二元系热导系数呈非线性，以及因热导性能差而使对流作用在热