GSTPi表达与大肠癌化疗前后细胞增殖与凋亡的关系

1、    GSTPi表达与大肠癌化疗前后细胞增殖 与凋亡的关系        【摘要】目的探讨大肠癌组织胎盘型谷胱甘肽S-转移酶（GSTPi）表达与其化疗耐药性的关系。方法对64例经术前化疗的大肠癌病例化疗前后的标本分别作GSTPi和核增殖抗原(PCNA)单抗LSAB法免疫组织化学染色，以及原位末端标记(TUNEL)法染色，分析GSTPi表达与大肠癌化疗前后核增殖抗原(PCNA)计数值和凋亡指数变化的关系。结果结论GSTPi在大肠癌组织中过量表达不仅可对抗化疗药物抑制

2、癌细胞增殖的作用，尚可对抗其促进癌细胞凋亡的作用。我们认为GSTPi过量表达与临床大肠癌化疗耐药性有关，可作其预测指标。【关键词】结肠直肠癌外科手术病理学，临床 GSTPi expression and its relationship with PCNA and apoptosis in colorectal carcinomas undergoing chemotherapySONG ErweiCHEN JishengZHANG Jieet al.Department of Surgery, Sun Yat San Memorial Hospital of Sun Yat SanUnive

3、rsity of Medical Sciences, Guangzhou 510120【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between GSTPi (Glutathion-S-Transferase) expression in colorectal carcinomas and their response to chemotherapy. MethodsWe used LSAB immunohistochemical technique to study the expression of GSTPi in 64 cases of

4、 colorectal cancinomas undergoing chemotherapy. Meanwhile, by determination of PCNA (proliferative cell nuclear antigen) and Tunel (TdT-mediated X-dUT nick end labeling) staining, we detected the proliferative activity and apoptosis of cancer cells before and after chemotherapy, whose relationship t

5、o GSTPi expression was then investigated respectively. ResultsColorectal cancinomas in 42 out of 64 cases (65.6%) were positively stained with GSTPi monoclonal antibodies. Changes of PCNA and apoptotic index of cancer cells were not obvious in GSTPi positive colorectal cancers after chemotherapy (P&

6、gt;0.05). However, the PCNA in GSTPi negative ones decreased significantly after chemotherapy (P<0.01), and their apoptotic index was greatly increased (P<0.01).ConclusionsExcessive expression of GSTPi in colorectal cancers can not only help to resist the proliferation inhibiting action of che

7、motherapy, but also antagonize its apoptosis enhancing effect. Hence, the authors came to the conclusion that overexpression of GSTPi was associated with multi-drug resistance of colorectal cancer, which may act as a prognostic factor for chemotherapy resistance. 【Key words】Colorectal neoplaemsSurge

8、ry,operativePathology,clinical研究证明胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GSTPi)表达与癌细胞株的化疗耐药性有关1。但目前对GSTPi是否可作为恶性肿瘤化疗敏感性的预测指标尚存争议2。我们对64例经术前化疗的大肠癌病例化疗前的标本作了GSTPi免疫组化染色，并通过化疗前后癌细胞凋亡指数和核增殖抗原(PCNA)计数值的变化作为化疗效果的判断指标，分析GSTPi表达与大肠癌化疗耐药性的关系。对象与方法一、临床资料自1995年9月至1997年7月本院收治的64例大肠腺癌病人，男43例，女21例，年龄2778岁，中位年龄57岁。肿瘤位于升结肠8例，横结肠3例，降结肠6例，乙状结

9、肠17例，直肠30例。其中高分化腺癌10例，中分化33例，低分化7例，粘液腺癌14例。按Duke's分期A期12例，B期39例，C期10例，D期3例。所有病例术前在纤维结肠镜取活检证实诊断后予FOM方案(5FU400mg/m2,第15天；MMC5mg/m2,第1天；VCR1mg/m2,第1天)化疗一个疗程，化疗后2周手术。二、染色方法所有病例术前纤维结肠镜活检标本及手术切除标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，作石蜡切片厚4m，分别行GSTPi和PCNA单抗LSAB法免疫组化染色及TUNEL法原位凋亡细胞染色。1.LSAB法免疫组织化学染色：染色方法分别按照GSTPi和PCNA一抗(DAKO

10、公司)以及LSAB试剂盒(DAKO公司)说明书进行。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱至蒸馏水，分别加入GSTPi鼠抗人单抗(稀释度为150)和PCNA单抗(稀释度为1100)，室温下孵育30min，1400倍稀释生物素标定兔抗鼠免疫球蛋白，室温下孵育30min；1400倍稀释过氧化物酶标定Streptaidin，室温下孵育30min；DAB显色；苏木素复染。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替第一抗体。阳性标准：以细胞出现棕褐色颗粒为阳性染色。PCNA计数值：在40倍镜下计数1000个细胞中PCNA阳性细胞数，并以百分数表示。每例化疗前后PCNA计数值之差为PCNA降幅。2.TUNEL法原位凋亡细

11、胞染色：染色方法按原位凋亡细胞检测试剂盒(Boehringer Mannheim公司)说明书进行，切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精至蒸馏水，蛋白酶K(20mg/ml)液化20min，0.3%过氧化氢处理30min，加入TUNEL液(前由酶溶液与标记溶液混合)50l，室温下孵育60min，再加入Convertase-POD液50l，室温下孵育30min，DAB显色，苏木素复染，阳性对照以Dnasel作预处理，阴性对照以PBS代替TUNEL液。凋亡指数(AI)测定：以细胞出现棕褐色颗粒为阳性染色，即为凋亡细胞。每张切片各取500个癌细胞，算出其中凋亡细胞占细胞总数的百分数即为凋亡指数(AI)，每例化疗后

12、与化疗前凋亡指数之差为AI增幅。3.统计学方法所有数据采用t检验及方差分析进行显著性检验。结果64例大肠癌中呈GSTPi单抗阳性显色42例(65.6%)，染色分布在大肠癌细胞的胞浆和胞膜中，呈棕褐色颗粒状，灶状或片状分布(1)。各级分化的大肠癌GSTPi阳性率间无显著差异(P>0.05)，各分期大肠癌GSTPi阳性率间亦无显著差异(P>0.05)。化疗前大肠癌纤维结肠镜活检标本与化疗后手术切除标本GSTPi染色结果无差异。    1结肠癌GSTPi免疫染色阳性免疫组织化学LSAB法×200本组大肠癌组织PCNA染色局限于细胞核内，阳

13、性染色细胞呈散在分布，并见明显异质性(2)。另大肠癌组织TUNEL染色阳性细胞呈单个分布，胞核呈深褐色，胞体皱缩，有的细胞轮廓尚清楚，有的仅见胞核碎片呈阳性染色(3)。    2结肠癌化疗前PCNA免疫染色阳性免疫组织化学LSAB法×200    3结肠癌化疗前TUNEL染色阳性免疫组织化学LSAB法×200本组大肠癌化疗前GSTPi表达与化疗前后细胞凋亡指数(AI)和核增殖抗原计数值(PCNA)的关系见表1，2。表1GSTPi表达与化疗前后癌细胞PCNA计数值的关系组别例数平均PCNA计数值平

14、均降幅(d±Sd)化疗前化疗后t值P值GSTPi阳性4278±778±81.60>0.050.2±0.7GSTPi阴性2278±8*73±611.2<0.014.6±1.9     注与阳性组比较*t=0.304,P>0.05；t=13.2,P<0.01 表2GSTPi表达与化疗前后癌细胞凋亡指数的关系组别例数平均细胞凋亡指数平均增幅(d±Sd)化疗前化疗后t值P值GSTPi阳性422.9±0.42.9±0.41.33>0.0

15、50.1±0.4GSTPi阴性222.8±0.7*5.6±0.917.5<0.012.8±0.8注与阳性组比较*t=1.36,P>0.05；t=9.29,P<0.01 从表1，2中可看出，化疗前GSTPi阳性组的大肠癌平均细胞凋亡指数和PCNA计数值与阴性组无明显差异(P>0.05)。GSTPi阳性组化疗后PCNA计数值及凋亡指数与化疗前无明显差异(P>0.05)，而阴性组化疗后PCNA计数值显著低于化疗前(P<0.01)，凋亡指数则显著高于化疗前(P<0.01)。另GSTPi阳性组化疗前后PCNA降幅及凋亡指数

16、增幅均明显小于阴性组(P<0.01)。讨论化疗是大肠癌的重要治疗手段，但临床上仍有相当一部份大肠癌病例对多种化疗药物不敏感。这种对多种结构不同、作用方式不同的抗肿瘤药产生的交叉耐药性称为多药耐药性。GSTPi的过量表达被认为与癌细胞多药耐药机制的产生有关。GSTPi能把抗癌药产生的过氧化物还原为无毒物质，另外，它尚可抑制烷化剂化疗药物引起的癌细胞DNA交联，从而减低药物对癌细胞的杀伤作用1。我们研究的结果显示大肠癌组织GSTPi阳性率为65.6%，与国外报道的结果相近3，提示我们某些大肠癌对化疗药物不敏感可能与GSTPi表达有关。细胞耐药实验研究表明对多种化疗药物耐药的结肠癌细胞株GST

17、PimRNA和酶蛋白含量远高于相应的敏感株4,5。用GSTPi反义寡核苷酸表达载体转染到结肠癌细胞株中能提高其对多种化疗药物的敏感性6。但临床上对GSTPi表达是否可作为癌肿化疗耐药性预测指标尚存争议2。以往这方面的研究多以患者经术后化疗后生存期来判断化疗效果2，但生存期除了与肿瘤对化疗敏感性有关外，尚受其它很多因素影响。我们则直接测定化疗前后反映肿瘤细胞增殖状态的核增殖抗原(PCNA)计数值及反映细胞程序性死亡情况的凋亡指数变化来判断化疗效果。我们的研究发现，GSTPi阴性组的大肠癌患者化疗后PCNA计数值显著降低，而阳性组则无明显变化，另阴性组化疗前后PCNA下降幅度也显著大于阳性组。PC

18、NA是一种相对分子质量为36000的酸性核蛋白，其表达在细胞增殖周期G1后期开始升高，G1/S期交界达高峰，S期持续高水平7。经化疗后大肠癌PCNA计数值减少是抗肿瘤药物如5-FU等抑制肿瘤细胞DNA合成从而抑制其增殖的结果8，但该作用对GSTPi阳性组的大肠癌病例则不明显，也就是说GSTPi阳性的大肠癌组织对化疗药抑制癌细胞增殖这一方面的作用不敏感。另外，化疗药物如CTX等能使癌细胞DNA交联，破坏其DNA结构，从而促进其凋亡发生9。我们发现GSTPi阴性组大肠癌病例化疗后癌细胞凋亡指数显著上升，阳性组则变化不大，阴性组化疗前后细胞凋亡指数增幅明显较阳性组大。提示我们GSTPi表达能保护大肠

19、癌细胞在化疗药物作用时免受损伤，抑制抗癌药所引致的细胞凋亡，从而表现出抗凋亡方面的耐药性。可见GSTPi在大肠癌组织中表达不仅可对抗化疗药物抑制癌细胞增殖的作用，尚可对抗其促进癌细胞凋亡的作用。因而我们认为GSTPi过量表达与临床大肠癌化疗耐药性有关，可作其预测指标。作者单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院外科参考文献1Ramachandran C, Mead D, Wellham LL, et al. Expression of drug resistance-associated mdr-1, GST pi, and topoisomerase genes during c

20、ell cycle traverse. Biochemical Pharmacology.1995,49:545-552.2Peters WH, Roelofs HM, VanPutten WL, et al. Response to adjuvant chemotherapy in primary breast cancer: no correlation with expression of glutathione S-transferases. Bri J Cancer，1993, 68:86-92.3Mulder TP, Verspaget HW, Sier CF, et al. Gl

21、utathione S-transferase in colorectal tumors is predictive for overall survival. Cancer Res. 1995, 55:2696-2702.4Beaumont PO, Moore MJ, Ahmad K, et al. Role of glutathione S-transferases in the resistance of human colon cancer cell lines to doxorubicin. Cancer Res，1998，58:947-955.5Stammler G, Pommerenke EW, Masanek U, et al. Messenger RNA expression of resistance factors in human tumor cell lines. J Exper Ther Oncol，1996，1:39-48.6Ban N, Takahashi Y, Takayama T, et al. Transfection of glutathione S-transferase(GST)-Pi antisense comple