肿瘤抗原触发M-CSF和IFN-γ联合基因转染的巨噬细胞抗肿瘤转移作用的研究

1、肿瘤抗原触发M-CSF和IFN-联合基因转染的巨噬细胞抗肿瘤转移作用的研究【摘要】目的本研究探讨了肿瘤抗原触发的M-CSF和IFN-基因联合转染的巨噬细胞对黑色素瘤实验性肺转移的治疗作用及其免疫机理。方法将联合基因转染的巨噬细胞经尾静脉回输治疗黑色素瘤实验性肺转移小鼠，经治疗后于荷瘤后第17天处死小鼠，计数荷瘤小鼠的肺部转移结节数并观察其长期存活期，用51资料的t检验处理数据。 结果联合基因转染后治疗组的小鼠长期存活率为16%，加用肿瘤抗原触发后的治疗组有33%的小鼠长期存活。小鼠脾细胞经体外诱导的CTL对野生型B16. F10细胞的杀伤活性，在经肿瘤抗原触发的M-CSF和IFN-联合基因转染

2、巨噬细胞治疗的荷瘤小鼠最高，与用未经抗原触发的联合基因转染巨噬细胞治疗组差异有显著性(P98%，比活性4106U/mg，其活性单位用Genzyme公司的基因重组人IL-2标准品加以标定；放射性同位素Na251CrO4购自Amersham公司。2. M制备及基因转染1：用mIFN-、hM-CSF基因单独或联合转染新鲜分离的小鼠巨噬细胞，同时设立转染LacZ基因的病毒对照和未经基因转染的细胞对照。重组腺病毒转染106巨噬细胞/ml 4小时、8小时、16小时、24小时、2、4、6、10天后收集上清，-20冻存备测。通过相应的试剂盒按使用说明书用ELISA法检测上清中小鼠IFN-和人M-CSF的分泌水

3、平。3.肿瘤抗原制备：按照常规可溶性抗原的制备方法2，收集对数期生长的B16.F10黑色素瘤细胞，用培养基配成107/ml，反复冻融45次，离心(5000r/min 30分钟)收集上清，该肿瘤冻融物(主要是可溶性抗原)用作肿瘤抗原(简称Ag)。较使用单一的抗原成分有一定的优越性，抗原提呈细胞可以自由选择提呈所需的抗原成分。大量制备同一批该种肿瘤冻融物供体内体外实验使用，避免批内差异。4.实验分组及治疗：将对数生长期的黑色素瘤细胞(B16. F10)用0.25%胰酶/EDTA消化2分钟，将其用RPMI 1640配成106 /ml，给C57BL/6小鼠尾静脉注射(每只0.1ml，即105细胞/鼠)

4、，接种3天后，以此为实验性肺转移小鼠模型随机分为12组，每组6只，分别给予以下不同治疗：A组：未治组(B16. F10)B组：RPMI 1640对照(RPMI 1640)C组：未处理的M(M)D组：未处理的M+肿瘤抗原(M+Ag)E组：对照基因LacZ转染的M(M-LacZ)F组：LacZ基因转染的M+肿瘤抗原(M-LacZ+Ag)G组：M-CSF基因转染的M(M-M-CSF)H组：M-CSF基因转染的M+肿瘤抗原(M-M-CSF+Ag)I组：IFN-基因转染的M(M-IFN-)J组：IFN-基因转染的M+肿瘤抗原(M-IFN-+Ag)K组：M-CSF、IFN-联合基因转染的M(M-IFN-+

5、M-CSF)L组：M-CSF、IFN-联合基因转染的M+肿瘤抗原(M-IFN-+M-CSF+Ag)上述治疗的M经常规分离、贴壁纯化后进行基因转染，18小时后肿瘤抗原刺激组加入5倍于M量的B16. F10黑色素瘤细胞制备的肿瘤抗原作用4小时后，用培养基洗3遍，去除肿瘤抗原，再用细胞刷轻轻刮取，1000转/分钟离心5分钟，将细胞配成107/ml，尾静脉注射，每只0.1ml，每4天治疗1次，连续2次。观察小鼠长期存活期。同样的小鼠每组4只,经治疗后于荷瘤后第17天处死小鼠，计数肺部转移结节数并检测CTL活性。5. 小鼠脾细胞CTL体外诱导及活性检测：将野生型B16. F10黑色素瘤细胞体外扩增后，经

6、50Gy 60Co照射抑制其增殖能力，保留其抗原性，用于体外诱导脾CTL细胞。取上述荷瘤小鼠脾脏制成的脾淋巴细胞悬液，按常规方法制备T淋巴细胞，调至5106/ml，将其与灭活的B16黑色素瘤细胞以201的比例置于含IL-2 100U/ml、10%小牛血清的RPMI1640中，每3天补加完全培养液一次，继续培养至第7天；待细胞生长状态良好，收集悬浮的细胞作为CTL效应细胞，以野生型B16.F10黑色素瘤细胞作为靶细胞，采用4小时51Cr释放法检测CTL活性，效靶比为101。实验中自然释放率均低于20%，CTL活性按下式计算：6.统计学处理：采用未配对计量资料的t检验。结果1. 腺病毒介导IFN-

7、，M-CSF基因转染的巨噬细胞培养上清中细胞因子的检测：从1可见，LacZ基因转染的病毒对照和未经基因转染的细胞对照上清中未检测到M-CSF和IFN-；IFN-基因转染4小时后即可从培养上清中检测到一定水平的IFN-，基因转染后10天仍可在其上清中检测到IFN-(达每毫升12.8ng/106细胞)；M-CSF基因转染后8小时可从上清中检测到M-CSF，24小时达最高，为每毫升11.2ng/106细胞，联合转染后细胞因子的水平略有减低，与LacZ基因转染组和未转染的巨噬细胞对照差别有非常显著意义(P0.01)，可见M-CSF和IFN-基因已成功的转入巨噬细胞并高效表达。1基因转染的巨噬细胞分泌I

8、FN-(A)、M-CSF(B)的水平Fig 1. Levels of IFN-(A), M-CSF(B) in supernantants secretedby macrophages after adenovirus-mediated cytokine gene transfer2.实验性肺转移荷瘤小鼠经基因转染的巨噬细胞治疗后长期存活期观察：如2所示，对照组的小鼠2023天全部死亡。M-CSF或IFN-单基因转染M治疗组的小鼠存活期较对照组明显延长，但无荷瘤小鼠长期存活。经肿瘤抗原触发后的M并未显著延长荷瘤小鼠的存活期；联合基因转染M后治疗组的小鼠长期存活率为16%，加用肿瘤抗原的联合基因

9、转染的M治疗组有33%的小鼠长期存活。2基因转染的M治疗实验性肺转移荷瘤小鼠的存活期Fig 2. The survival period of tumor-bearing mice with pulmonarymetastases after treatment with gene-transfected macrophagesA: Without tumor antigen pulse， B: With tumor antigen pulse3.实验性肺转移荷瘤小鼠经治疗后肺部转移结节数：从附表可见，与RPMI 1640治疗组、未处理M治疗组及LacZ对照基因转染M治疗组相比较，未经肿瘤抗原

10、触发组中经IFN-单基因转染(P0.05)及M-CSF和IFN-联合基因转染M(P0.01)治疗的荷瘤小鼠肺部转移结节数明显减少；经肿瘤抗原触发后，经IFN-单基因转染的M或联合基因转染的M治疗的小鼠，肺部转移结节数明显较未经肿瘤抗原触发的M治疗组少(P0.05)，联合基因治疗组的效果优于单基因治疗组(0.01P0.05)，可见肿瘤抗原触发有助于提高基因转染的M抗肿瘤转移效果。联合基因转染组较单基因转染组能更好地抑制肺转移结节数。附表实验性肺转移小鼠治疗后肺部转移结节数Table. The number of pulmonary metastastic nodes of tumor-beari

11、ng mice after gene therapyGroupNumber of metastases(s),(n=4)B16. F10121.620.5RPMI 1640117.622.2M105.620.3M+Ag102.819.0M-LacZ103.418.4M-LacZ+Ag100.813.6M-M-CSF89.020.2M-M-CSF+Ag88.218.8M-IFN-77.811.2*M-IFN-+Ag58.215.1*M-M-CSF+IFN-47.817.9*M-M-CSF+IFN-+Ag23.811.8*4.肿瘤抗原触发的基因转染M治疗的荷瘤小鼠脾细胞CTL活性：从3可见，CTL

12、对野生型B16. F10细胞的杀伤活性，经肿瘤抗原触发的M-CSF和IFN-联合基因转染M治疗的荷瘤小鼠最高，与未经抗原触发的联合基因转染治疗组差异有显著性(0.01P0.05)；IFN-单基因转染治疗组与未经处理的M及LacZ对照基因转染组相比差异显著(P0.05)。该结果提示，IFN-单基因转染治疗组与联合基因转染的治疗组有可能通过有效地诱导小鼠体内特异性CTL而对转移性荷瘤小鼠产生治疗作用，肿瘤抗原的触发进一步增强了这种抗肿瘤转移作用。 3经治疗的荷瘤小鼠脾细胞经诱导的CTL杀伤活性Fig 3. CTL activity of tumor-bearing mice after treat

13、ment with M-CSFand/ or IFN- gene transfected，tumor antigen-pulsed macrophagesA:RPMI 1640，B:M，C:M+Ag，D:M/LacZ，E:M/LacZ+Ag，F:M/M-CSF ，G:M/M-CSF+Ag，H:M/IFN-，I:M/IFN-+Ag，J:M/IFN-+M-CSF，K:M/IFN-+M-CSF+Ag讨论巨噬细胞是体内的一类专职性抗原提呈细胞，在诱导机体特异性抗肿瘤免疫反应过程中起着十要重要的作用。Xu等3和本室于益芝4等研究表明，GM-CSF基因转染的M具有较强的抗原提呈功能，表明基因转染是增强M抗

14、原提呈功能的一条有效途径。抗原提呈细胞介导的特异性免疫治疗研究多集中于肿瘤特异性抗原5,6或肿瘤抗原提取物7触发的树突状细胞(Dendritic cells, DC)回输治疗，但因大量获取DC较困难以及已知的肿瘤特异性抗原的种类较少，所以应用激活抗原提呈细胞的特异性免疫治疗范围受到了很大的限制。本实验中我们选用M作为靶细胞，将两种与M功能密切的细胞因子的基因M-CSF和IFN-转入其中，以期在激活M效应功能的同时，增强其抗原提呈功能，通过肿瘤细胞提取物触发后诱导机体的特异性免疫功能而发挥其抗肿瘤作用。为了观察该种方案的治疗效果，我们采用体外M-CSF和IFN-基因修饰的并经肿瘤抗原触发的M回输

15、治疗黑色素瘤实验性肺转移小鼠，获得了较好的抗肿瘤转移作用。其中，经肿瘤抗原触发后的M的抗瘤效果优于未经肿瘤抗原触发的治疗组，小鼠存活期显著延长，肺部转移结节数减少，荷瘤小鼠CTL活性明显高于未经抗原触发组，这可能是因为前者在体外已将肿瘤抗原加工处理，将肿瘤抗原肽表达在细胞表面并与MHC结合形成复合物，进入体内后立即与淋巴细胞作用完成抗原呈递，使T细胞活化发挥抗肿瘤效应。这种经肿瘤抗原触发后的M在回输治疗之前，已具备了特异性和非特异性的抗瘤反应，而未经肿瘤抗原触发的M经尾静脉注射由于进入肺内后与肿瘤细胞作用时所加工处理的肿瘤抗原量有限，影响了其抗原提呈功能的发挥，这也表明M的抗原提呈功能的增强与

16、其体内抗肿瘤作用关系密切从而影响了其治疗效果。以上结果提示，体外经肿瘤抗原触发的M-CSF、IFN-联合基因转染的M过继回输疗法是肿瘤特别是转移性肿瘤的一种有效的免疫治疗手段。其回输体内后不仅可以直接发挥其免疫效应功能，而且可通过其抗原提呈功能的发挥，活化机体特异性的免疫功能，进一步增强其抗肿瘤效果。本研究受国家863项目(BH03-01-03)资助作者单位：200433 上海，第二军医大学免疫学教研室参考文献1雷虹，于益芝，曹雪涛,等.重组腺病毒介导IFN-基因转染的M的体外免疫效应功能分析. 中国免疫学杂志,1997，13(3)131-134.2Grabbe S, Bruvers S, B

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