血清成分分析

1、 血清成分分析 血清的成分分析主要从血清中的胆固醇、清蛋白、-球蛋白、谷丙转氨酶等几个方面来进行研究的。我主要从实验的目的、原理、实验试剂、实验过程和结果几个方面来进行分析概括。1、 实验目的1. 了解并掌握邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇的原理和方法。2. 掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法； 掌握凝胶过滤层析的技术方法；掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。3. 用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；学习治疗检测SGPT的方法及原理；了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。2、 实验

2、原理 血清胆固醇的定量测定原理：1. 胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用。产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。100mL样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。本法优点是操作简便（无须将样品中的胆固醇抽提出来或去除样品中的蛋白质），灵敏，稳定。蛋白质盐析的实验原理：1. 蛋白质分子是生物大分子，其大小恰好在胶体的范围，且分子中亲水基团多位于分子的表面，疏水基团多在分子结构内部。因此，蛋白质分子在水中能以胶体颗粒存在，形成胶体溶液。2.蛋白质在水中形成亲水胶体，亲水胶体颗粒有两个稳定因素：（1）胶粒上的电荷；（2）水化膜。3. 蛋白质在

3、水溶液中呈现两性电离。在环境的pHpI时，蛋白质可带正电荷或负电荷。在某一pH条件，蛋白质带同种电荷，同电相斥，故可吸引水分子（水分子为极性分子），水分子排列围绕在蛋白质分子周围，形成水化膜，使蛋白质分子相互分割开来。破坏这两个因素或其中某一个因素（破坏了蛋白质胶体的稳定性），易于蛋白质发生沉淀。4. 高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀，这就是蛋白质的盐析。5. 由于各种蛋白质的颗粒大小、带电荷多少及亲水程度的不同，对于同一种中性盐，蛋白质盐析所需最低浓度也不同。例如：球蛋白不

4、溶于半饱和的（NH4）2SO4溶液，-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白仅不溶于饱和的（NH4）2SO4溶液。因而。可以利用不同浓度的（NH4）2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。蛋白质透析与浓缩的实验原理：1. 透析（1） 透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。（2） 由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。2. 浓缩利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒

5、中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。 凝胶层析的实验原理：1. 凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。2. 当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。3. 当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。醋酸纤维素薄膜

6、电泳的原理：1. 醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。2. 醋酸纤维素薄膜是用二乙酸纤维素制成的，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅为120m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为取代电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用广泛、没有吸附等特点。谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）实验原理：观察肝糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肝糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。血清谷丙转氨酶活力单位测定实验原理：本实验用丙氨酸和-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2

7、，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数。三、实验器材和试剂1.试管1.5cm×15cm（×7）、吸管0.1mL（×3）、0.5mL（×4）、5mL（×1）、10mL（×1）、容量瓶50mL（×1）、100mL（×1）、烧杯100mL（×2）、电子分析天平、分光光度计、离心机、移液管、透析袋、铁架台、凝胶柱、玻璃棒、烧杯、试管、胶头吸管、 9%NaCl溶液、 海砂、1%谷氨

8、酸溶液（1%KOH溶液中和）、%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）、0.1%KHCO3溶液、0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）、2%乙酸溶液、酚的饱和水溶液、 0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液、0.1%标准谷氨酸溶液、0.1%标准丙氨酸溶液、KOH溶液。2.邻苯二甲醛试剂、90%醋酸 、混合酸、标准胆固醇贮液（1mg/mL）、标准胆固醇应用液（0.1mg/mL）、(NH4)2SO4溶液、双缩脲试剂、酪蛋白、蔗糖、BaCl溶液、Sephandex 4B 凝胶、生理盐水、重铬酸钾 、蓝葡聚糖、家鸡肝脏、家鸡和乌鸡血清、1/15 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液、GPT基质液、1mmo

9、l/L2，4-二硝基苯肼、2mol/mL丙酮酸钠标准液、0.4mol/LNaOH溶液四实验结果和分析1.血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）操作：1、标准曲线的绘制2、样品的测定实验结果： 标准曲线的绘制：编号试剂编号编号编号编号编号01234标准胆固醇应用液/mL00.10.20.30.4醋酸/mL0.40.30.20.10邻苯二甲醛试剂/mL0.20.20.20.20.2蒸馏水/mL0.010.010.010.010.01混合酸/mL4.04.04.04.04.0100mL血清中总胆固醇含量/mg0100200300400A550nm00.2180.4250.6150.764 样品的测定：

10、试管试剂对照样品醋酸/mL0.40.4血清/mL0.010.01邻苯二甲醛试剂/mL00.2无水乙醇/mL0.20混合酸/mL*4.04.0A550nm（家鸡）00.019A550nm（乌鸡）00.004结果分析：由标准曲线可得：100ml血清中总胆固醇的含量为20mg,乌鸡中有2mg，可得实验结果为家鸡相同含量的血清中总胆固醇的含量高于乌鸡。实验可能存在的误差为：1. 血清取得量较少，并且在取乌鸡的血清时有部分滴在试管壁的上方，没有溶解在溶液中；2. 比色时没有混匀或时间过长，比色的效果不明显，影响了光吸收值；3. 标准曲线的绘制存在一定的误差。2. 血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定操作：血

11、清清蛋白与-球蛋白的盐析实验步骤：血清清蛋白与-球蛋白的盐析实验步骤取离心管一支，加入2mL血清加入2mLPBS（稀释血清），摇匀逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，边加边摇静止30min，离心20min（v=3000rpm）上清液（主要含有清蛋白）沉  淀（主要含有-球蛋白）加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液饱和加1mLPBS溶解静止30min逐滴加入饱和（NH4）2SO4溶液0.5mL（相当于33%饱和（NH4）2SO4溶液）离心、沉淀加1mLPBS溶解沉淀放置30min放入透析袋离心20min（v=3000rpm）*放弃离心后的上清液（主要是、球蛋白）

12、，沉淀即为初步纯化的-球蛋白蛋白质透析与浓缩的实验步骤：1. 取玻璃纸（15cm×15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。2. 用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，将烧杯放在微量振荡器上振荡1h（中间换水1-2次）。3. 将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸收袋内的液体放入干净的试管中。4. 用双缩脲法分别检查袋内外液体蛋白质。在用BaCl溶液检查烧液体的NH4+和SO42-。记录实验现象，观察透析法除盐的结果。5. 将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。凝胶层析的实验步骤过程名

13、称实验步骤凝胶预处理4g葡萄糖胶G-25放入100mL烧杯中50mL蒸馏水小火煮沸1h静止、冷却、倾弃蒸馏水加入PBS10mL轻轻搅拌至凝胶悬起倾入10cm×1.0cm层析柱（用玻璃棉堵住下口，下口套一橡皮管）装柱    将全部凝胶都倾入柱内，且液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，在将柱内凝胶面上平铺一张小圆滤纸片，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出，到液体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。加样    用胶头吸管将滤纸上方清液吸出，加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口，安装生理盐水加入装置。洗脱&

14、#160;   用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使液体的流速达到6-7dpm。收集混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。醋酸纤维素薄膜电泳实验步骤浸泡    将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。点样    用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。电泳    将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点

15、样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。染色    将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重，染色10min。漂洗    将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。实验结果：结果分析：1. 凝胶层析的结果如上图所示，混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方，用试管收集流出的液体，观察液体的颜色以及不同颜色的液体的含量。2. 全血清、-球蛋白、血清清蛋白的薄膜电泳图。全血清中有三条线，其中有一条最粗，另外两条较模糊，-球蛋白和血清清蛋白中只能看到一条淡淡的

16、线，造成这种现象的原因可能是：1.点样的时候点的较少、不均匀；2.操作不当导致-球蛋白和谢清清蛋白受到了损失，含量减少。3.谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定操作： 谷丙转氨酶提取液制备：谷丙转氨酶提取液制备方法2g肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂200mg在低温下，研磨成浆用脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）试    剂对照管测试管0.1moL/L谷氨酸0.500.500.1moL/L丙酮酸钠0.500.500.1%KHCO30.500.500.025%一溴乙酸0.250.25煮沸的酶液0.50酶液0.50加脱脂棉塞，45水浴，1.5h，时时振荡内容物2%乙酸

17、6滴6滴沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析纸层析方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆通过中心将滤纸绘成四等分扇形，用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm）在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h）80-100烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100显色 血清谷丙转氨酶活力单位测定:1. 标

18、准曲线的绘制2. 酶活力的测定实验结果：试     剂试管号012345丙酮酸钠标准液（mL）0.050.100.150.200.25GPT基质液（mL）0.500.450.400.350.300.25pH7.4磷酸缓冲液（mL）0.100.100.100.100.100.10充分摇匀后，置于37水浴，保温10min2，4-二硝基苯肼（mL）0.500.500.500.500.500.50充分摇匀后，置于37水浴，保温20min0.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.005.005.005.00充分摇匀，室温静置10min后，以0号管为空白，

19、520nm波长下比色A520nm值00.1510.2670.4210.5110.632各管所含丙酮酸量（mol）0.100.200.300.400.50各管相当GPT单位数100200300400500以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。（1）丙酮酸钠标准液mL数×摩尔浓度（2mol/mL）；（2）GPT活力单位为：每mL血清在37与pH=7.4的基质液作用60min，生成1mol丙酮酸为一个单位（U）。本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果×1000即可。试