自然选育和诱变育种

1、关于自然选育和诱变育种第一页，共65页幻灯片 第四章 自然选育和诱变育种第二页，共65页幻灯片第三页，共65页幻灯片 第一节第一节 自然选育自然选育 自然选育：不经人工处理，利用微生物自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程的自然突变进行菌种选育的过程 一、引起自然选育的因素一、引起自然选育的因素 1、低剂量的诱变效应、低剂量的诱变效应 2、互变异构效应、互变异构效应第四页，共65页幻灯片基因突变基因突变第五页，共65页幻灯片二、微生物突变的类型二、微生物突变的类型1、 形态突变型2、致死突变型3、抗性突变型4、营养缺陷型突变型 第六页，共65页幻灯片三、微生物突变的特点

2、三、微生物突变的特点1 1、 不对应性不对应性2 2、 自发性自发性3 3、 稀有性稀有性4 4、 独立性独立性5 5、 诱变性诱变性6 6、 稳定性稳定性7 7、 可逆性可逆性 第七页，共65页幻灯片第八页，共65页幻灯片 第二节、第二节、 诱变育种诱变育种 一一 概念：概念： 诱变育种是利用各种诱变剂处诱变育种是利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法频率，再通过适当的筛选方法获得高产优质菌种的育种方法。获得高产优质菌种的育种方法。 第九页，共65页幻灯片二二 诱变育种的原理诱变育种的原理 基因突变基因突变:染色体畸变和染色体畸变和点突

3、变。点突变。染色体畸变：指的是染色体或染色体畸变：指的是染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆片段发生缺失、易位、逆位、重复等。位、重复等。点突变：指的是点突变：指的是DNA中的碱基发中的碱基发生变化。生变化。 第十页，共65页幻灯片三、常用的诱变剂种类三、常用的诱变剂种类1 1、物理诱变剂：紫外线、快中子、物理诱变剂：紫外线、快中子 2 2、化学诱变剂：、化学诱变剂：5 5BUBU（5-5-溴尿嘧啶）溴尿嘧啶） 硫酸二乙酯，亚硝基胍硫酸二乙酯，亚硝基胍3 3、生物诱变剂：噬菌体、生物诱变剂：噬菌体第十一页，共65页幻灯片3、使用方法：单一诱变剂处理:复合诱变剂处理：第十二页，共65页幻灯片诱变

4、育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。 第十三页，共65页幻灯片 四四、常用诱变、常用诱变剂的具体使用方剂的具体使用方法：法： 1 1、紫外线：紫外线：第十四页，共65页幻灯片 A A、诱变处理前，先开紫外灯预热、诱变处理前，先开紫外灯预热2020分钟，分钟，使光波稳定。使光波稳定。 B B、将、将3 35ml5ml细胞悬浮液置于培养皿细胞悬浮液置于培养皿, ,于于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射诱变箱内的电磁搅拌器上，照射3 35 5分分钟，进行表面杀菌。钟，进行表面杀菌。 C C、打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边、打开培养皿

5、盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌。照射边搅拌。 D、处理一定时间后，在红外灯下，吸取一定量菌液，经稀释后，取0.2毫升涂平板 。第十五页，共65页幻灯片 2. 5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶： A、称取、称取5-溴尿嘧啶，加入无菌生理盐水溴尿嘧啶，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为微热溶解，使浓度为2mg/ml。 B、将细胞培养至对数期并重悬于缓冲液、将细胞培养至对数期并重悬于缓冲液或生理盐水中过夜。或生理盐水中过夜。 C、将、将5-溴尿嘧啶加入培养基内，一般为溴尿嘧啶加入培养基内，一般为1020微克微克/ ml，倒平板。，倒平板。 D、涂布菌液，在生长中诱变，挑单菌落、涂布菌液，在生长中诱变，挑单菌落

6、进行测定。进行测定。第十六页，共65页幻灯片五、诱变育种的一般程序第十七页，共65页幻灯片出发菌株出发菌株 菌种纯化菌种纯化同步培养同步培养制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液诱变剂处理诱变剂处理 平板分离平板分离挑选疑似突变菌落纯培养挑选疑似突变菌落纯培养突变体的初步筛选突变体的初步筛选 重复筛选重复筛选选出突变体选出突变体 第十八页，共65页幻灯片1、同步培养、同步培养 诱变处理前，菌悬液的诱变处理前，菌悬液的细胞应尽可能达到同细胞应尽可能达到同步生长状态，培养出步生长状态，培养出生理活性一致的细胞。生理活性一致的细胞。同步生长细胞的培养就及其收集 第十九页，共65页幻灯片第二十页，共65页幻

7、灯片2.孢子或菌体悬浮液的制备孢子或菌体悬浮液的制备 用生理盐水或缓冲溶液配制，先用无菌的玻用生理盐水或缓冲溶液配制，先用无菌的玻璃珠振荡分开，再用脱脂棉过滤。璃珠振荡分开，再用脱脂棉过滤。第二十一页，共65页幻灯片 3变异菌株的初步筛选变异菌株的初步筛选 1）利用形态突变直接淘汰低产变异菌株。）利用形态突变直接淘汰低产变异菌株。 2）利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。）利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。 第二十二页，共65页幻灯片饱浸含某种指示剂饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤的固体培养基的滤纸片变色圈纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固体培养指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈

8、。如淀基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液粉的平皿上喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性差、固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转选菌具有该营养物的前体转化成营养物化成营养物 能力，工具菌能力，工具菌就能围绕该菌生长就能围绕该菌生长 待筛选的菌株能分待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制泌产生某些能抑制工具菌生长的物质工具菌生长的物质

9、 第二十三页，共65页幻灯片第三节第三节 营养缺陷型突变体的筛选及应营养缺陷型突变体的筛选及应用用 一、营养缺陷型：指通过诱变而产生的丧失一、营养缺陷型：指通过诱变而产生的丧失了合成某种营养物质了合成某种营养物质 的能力，必须在基本的能力，必须在基本培养基中加入相应缺陷的物质才能正常生培养基中加入相应缺陷的物质才能正常生长的变异菌株。长的变异菌株。第二十四页，共65页幻灯片 二、筛选营养缺陷型的培养基二、筛选营养缺陷型的培养基 ： 基本培养基基本培养基- :凡是能满足某种野生菌株凡是能满足某种野生菌株 营养要求最低成分的合成培养基。营养要求最低成分的合成培养基。 完全培养基完全培养基:凡能满足

10、一切营养缺陷株营养凡能满足一切营养缺陷株营养需要的培养基需要的培养基+ 。第二十五页，共65页幻灯片 补充培养基补充培养基A：只能满足相应的营养缺：只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。陷型生长需要的组合培养基。第二十六页，共65页幻灯片三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法 1.诱变处理诱变处理2.淘汰野生型淘汰野生型第二十七页，共65页幻灯片 A、抗菌素法: 将抗生素加入到基本培养基中，杀死生长野生型菌株，浓缩营养缺陷型。第二十八页，共65页幻灯片第二十九页，共65页幻灯片B、菌丝过滤法、菌丝过滤法: 诱变后的孢子在诱变后的孢子在中培养一段时间后中培养一段

11、时间后过滤，去除过滤，去除大部分野生型菌株，浓缩营养缺陷型大部分野生型菌株，浓缩营养缺陷型 。Sartorius正压式过滤器正压式过滤器第三十页，共65页幻灯片三、检出所需缺陷型三、检出所需缺陷型 逐个检出法逐个检出法 经诱变处理后的细胞涂布在平板上，待长出单经诱变处理后的细胞涂布在平板上，待长出单个菌落后，用接种针将这些单个菌落逐个依次个菌落后，用接种针将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基地分别接种到基本培养基和另一完全培养基 。经培养后，如果在完全培养基上的某一部位。经培养后，如果在完全培养基上的某一部位上出现菌落，而在基本培养基上却不长菌上出现菌落，而在基本培养基

12、上却不长菌 ，说明这是一个营养缺陷型。说明这是一个营养缺陷型。 第三十一页，共65页幻灯片三、检出所需缺陷型三、检出所需缺陷型 影印培养法影印培养法 将长出菌落的平皿开口朝下，在丝绒布上轻轻地印将长出菌落的平皿开口朝下，在丝绒布上轻轻地印一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落，如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后，如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后一培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营一培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营养缺陷型。

13、养缺陷型。第三十二页，共65页幻灯片第三十三页，共65页幻灯片一般从菌落大小也可一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺落较小，即是营养缺陷型陷型 夹层培养法 A A、夹层培养法、夹层培养法: :先在培养皿中倒一薄层不先在培养皿中倒一薄层不含菌的基本培养基，待冷凝后加上一层含菌的基本培养基，待冷凝后加上一层含诱变处理菌液的基本培养基，其上再含诱变处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基。经培养浇一薄层不含菌的基本培养基。经培养后在培养皿底用笔对首次出现的菌落作后在培养皿底用笔对首次出现的菌落作记号，然后再在其上倒一薄层完全培养记号，然后再在其上倒一

14、薄层完全培养基。再经培养后所出现的新菌落，多数基。再经培养后所出现的新菌落，多数为营养缺陷型。为营养缺陷型。第三十四页，共65页幻灯片 四四.鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型生长谱法生长谱法第三十五页，共65页幻灯片方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混 合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测定菌进行多

15、种营养因子进行测定 方法二：在基本培养基中加入某种营养物质方法二：在基本培养基中加入某种营养物质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此法可同时对多个菌株进行测定法可同时对多个菌株进行测定第三十六页，共65页幻灯片第三十七页，共65页幻灯片五、 营养缺陷型突变株的应用 1.工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物 2.作为杂交、重组育种的遗传标记 3.用于微生物代谢途径研究 4.在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中用作标记菌株第三十八页，共65页幻灯片营养缺陷型的应用实例营养缺陷型的应用实例 利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子利

16、用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子 第三十九页，共65页幻灯片天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶(AK)(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制 通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制且因为消除了反馈抑制 突变型能过量生产突变型能过量生产L-L-赖氨酸赖氨酸 第四十页，共65页幻灯片第四节第四节 温度敏感突变株的筛选温度敏感突变株的筛选 一、温度敏感

17、突变株（一、温度敏感突变株（temperature-sensitive mutant, TS突变体）：突变体）： 突变株在一定温度范围内（许可温度）正突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型和野生型没有区别，但超常生长，其表型和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度），则不能出这一温度范围（非许可温度），则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢停止或减弱。某些代谢停止或减弱。 第四十一页，共65页幻灯片二、二、TS突变的原理突变的原理 TSTS突变主要是由必需基因发生突变，致突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温度条件下

18、无法正常表使该基因在一定温度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造成细胞不能达，或其编码的酶失活，造成细胞不能正常生长。正常生长。第四十二页，共65页幻灯片三、三、 TS TS突变株的选育方法突变株的选育方法（一）（一） TS TS突变株的诱发突变株的诱发 TSTS突变主要由基因错义突变所致，要选择突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、化合物，或亚硝酸、UVUV等诱变剂。等诱变剂。（二）（二） 淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株/TS/TS菌株富集培养菌株富集培养 抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下抗生素法：加

19、入抗生素，在非许可温度下培养一定时间，杀灭在该温度下生长的野培养一定时间，杀灭在该温度下生长的野生型菌株，再离心除去抗生素，分离生型菌株，再离心除去抗生素，分离 第四十三页，共65页幻灯片四、TS突变株分离筛选 富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养，再用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可，再用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可温度下分别培养，对照结果即可检出温度下分别培养，对照结果即可检出 TSTS突变体；突变体； 也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型菌株，做好记号，再转许可温度培养，则后长出的菌株，做好记号，再转许可温度培养，则后长出的为为TSTS菌株。菌株。第四十四页，共65页幻灯片五、五、 TS突变株在发酵工业中应用突变株在发酵工业中应用1 1、 在谷氨酸发酵中的应用在谷氨酸发酵中的应用 增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结构增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结构和功能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷氨酸和功能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷氨酸非积累型转变为积累型。非积累型转变为积累型。如：以乳糖发酵杆菌如：以乳糖发酵杆菌NO2256NO2256为出发菌株，选育出细胞膜为出发菌株，选育出细胞膜结构或功能缺损的结构或功能