食品理化检验氨基酸及蛋白质

1、食品理化检验氨基酸及蛋白质第三节第三节 食品中蛋白质和氨基酸的测定食品中蛋白质和氨基酸的测定Determination of protein and amino acid in Food复习一下复习一下1.1.蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 C C：50-55% H50-55% H：6-8% O6-8% O：20-23% 20-23% N N：15-18% S15-18% S：0-4%0-4% 微量元素：还含有微量的微量元素：还含有微量的 P P、CuCu、FeFe、I I 等等2.2.基本结构单位：氨基酸基本结构单位：氨基酸3.3.蛋白质的变性作用。蛋白质的变性作用。（一）蛋白质的生理功能

2、及在食品中的作（一）蛋白质的生理功能及在食品中的作用用（二）食品中的蛋白质含量（二）食品中的蛋白质含量（三）蛋白质系数（三）蛋白质系数（四）蛋白质水解（四）蛋白质水解（五）蛋白质测定方法（五）蛋白质测定方法一、概述一、概述 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分；重要成分； 维持人体的酸碱平衡、水平衡；维持人体的酸碱平衡、水平衡； 物质的代谢及运转都与蛋白质有关物质的代谢及运转都与蛋白质有关; ; 蛋白质是食品的最重要的营养指标。其含量与分解产蛋白质是食品的最重要的营养指标。其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。物直接影响食品的

3、色、香、味。（一）蛋白质的生理功用及在食品中的作用（一）蛋白质的生理功用及在食品中的作用不同食品蛋白质的含量不同，可作为质量检验的一种重要手段。不同食品蛋白质的含量不同，可作为质量检验的一种重要手段。( (二二) ) 食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量谷类和面食：谷类和面食： （% %）大米（糙米、长粒、生）大米（糙米、长粒、生） 大米（白米、长粒、生）大米（白米、长粒、生） 小麦粉（整粒）小麦粉（整粒） 玉米粉（整粒、黄色）玉米粉（整粒、黄色） 玉米淀粉玉米淀粉 豆类：豆类：大豆（成熟的种子、生）大豆（成熟的种子、生） 豆（腰子状、所有品种）豆（腰子状、所有品种） 豆腐（生、普通）豆腐（生

4、、普通） 水果和蔬菜：水果和蔬菜：苹果（生、带皮）苹果（生、带皮） 芦笋（生）芦笋（生） 草莓（生）草莓（生） 莴苣（冰、生）莴苣（冰、生） 肉、家禽、鱼：肉、家禽、鱼：牛肉（颈肉、烤前腿）牛肉（颈肉、烤前腿） 牛肉（腌制、干牛肉）牛肉（腌制、干牛肉） 鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生）鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生） 火腿（切片、普通的）火腿（切片、普通的） 鸡蛋（生、全蛋）鸡蛋（生、全蛋） 鱼（太平洋鳕鱼、生）鱼（太平洋鳕鱼、生） 鱼（罐装金枪鱼滴干的固体）鱼（罐装金枪鱼滴干的固体） 乳制品：乳制品：牛乳（全脂、液体）牛乳（全脂、液体） 牛乳（脱脂、干）牛乳（脱脂、干） 干酪干酪 酸奶（普通的、低脂）酸

5、奶（普通的、低脂） （三）蛋白质系数（三）蛋白质系数 在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。作用。 蛋白质蛋白质胨胨肽肽氨基酸氨基酸利用蛋白质共性的方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法凯氏定氮法杜马斯法杜马斯法福林酚法福林酚法染

6、色法染色法1.1.原理原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱，中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱，在氢氧化钠的作用下，经水蒸气蒸馏使氨蒸出，用过在氢氧化钠的作用下，经水蒸气蒸馏使氨蒸出，用过量的硼酸溶液吸收后，再以盐酸或硫酸标准溶液滴定，量的硼酸溶液吸收后，再以盐酸或硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量，并换算成蛋白质含量。根据酸的消耗量计算含氮量，并换算成蛋白质含量。 消化消化2NH

7、2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点作为增温剂，提高溶液沸点加氧化剂加氧化剂 加速有机物氧化速度加速有机物氧化速度u 作为增温剂，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，而加快有机物分解；u 一般纯硫酸的沸点在3400C左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解 ，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高，其反应式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度

8、过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。 催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 可以指示消化终点的到达准确称取样品，置于凯氏烧瓶中；准确称取样品，置于凯氏烧瓶中；加入硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸摇匀；加入硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸

9、摇匀；置于电炉上，成置于电炉上，成4545度角，小火加热。度角，小火加热。待泡沫停止后，加大火力，保持微待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液体变蓝绿色透明，再继续沸，至液体变蓝绿色透明，再继续加热加热1h1h，取下冷却后，小心加入水，转移至取下冷却后，小心加入水，转移至1000ml1000ml容量瓶，定容，作为样品液容量瓶，定容，作为样品液备用，同时做空白试验。备用，同时做空白试验。l按图安装好微量定氮蒸馏装置;l于水蒸气发生瓶内装水装水至2/3容积处，加指示剂数滴及硫酸硫酸数毫升，以保持水呈，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。l在加入硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下

10、。 用硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定至灰色为终点用硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定至灰色为终点 指示剂：混合指示剂（甲基红指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲酚绿）溴甲酚绿） 指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸） （碱）（碱） （酸）（酸）2NH + 4H BO =(NH ) B O +5H O (NH ) B O +2HCl+5H O=2NH Cl+4H BOX =1000W%100K)(CMVVN21半微量凯氏定氮蒸馏装置半微量凯氏定氮蒸馏装置（1）测得的是粗蛋白含量（总氮量，含非蛋白氮）；（2）所用试剂应用配制；（3）消化过程应注意凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以

11、促进消化完全。（4）若样品含脂肪或糖较多时，消化时易产生大量泡沫，可加少量辛醇或液体石蜡，或硅油消泡剂，并注意适当控制热源强度（要小火加热）。（5）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L23ml后再加热。过氧化氢注意事项注意事项（5）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解

12、液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。（7）蒸馏过程应注意接头处无现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（8）不应超过40C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（9）混合指示剂在碱性溶液中呈，在中性溶液中呈，在酸性溶液中呈。特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化多个样品，）快速：一次可同时消化多个样品， 消化时间短；消化时间短；（3）自动

13、：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，计算总氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样。个样。 1、试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？ 2、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？ 3、硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？ 作作 业业氨基酸的测定氨基酸的测定Determination of amino acid in Food氨基酸的测定方法氨基酸的测定方法 氨基酸

14、分析仪法（国标法）氨基酸分析仪法（国标法） 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC)HPLC) 气相色谱法（气相色谱法（GC)GC) 荧光分光光度法荧光分光光度法 紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法1、原理、原理 利用氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，利用氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的谱柱顶端后，采用不同的pHpH值和离子浓度的缓冲溶液即可值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显

15、色，将它们依次洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。定量依据：是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的定量依据：是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。长处定量测定。 氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法2. 操作方法操作方法 （1 1）样品处理：）样品处理：测定样品中各种游离氨基酸含量，可测定样品中各种游离氨基酸含量，

16、可以除去脂肪等杂质后，直接上柱进行分析。以除去脂肪等杂质后，直接上柱进行分析。 测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。酸水解的方法：称取经干燥的蛋白质样品盐酸，置于酸水解的方法：称取经干燥的蛋白质样品盐酸，置于110110 C C烘箱内水解烘箱内水解2424小时，然后除去过量的盐酸，加缓冲小时，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀。取一定量的水解样品上柱溶液稀释到一定体积，摇匀。取一定量的水解样品上柱进行分析。进行分析。 氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法

17、如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除质，必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方法如下杂质的方法如下: : 去糖和淀粉去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物；涤，得蛋白质沉淀物； 去脂肪：去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物；溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物； 去核酸：去核酸：将样品在将样品在10%10%氯化钠溶液中，氯化钠

18、溶液中，8585加热加热6 6小时，小时，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可；然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可；去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。子交换树脂进行去盐处理。氨基酸分析仪法氨基酸分析仪法（2 2）样品分析：）样品分析： 经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量视所经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量视所用自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸用自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸 molmol左右左右( (水解样品干重为左右水解样品干重为左右) )；生成的紫色物质在