达托霉素的HPLC的方法学研究

1、 摘要 建立达托霉素含量和有关物质的测定方法。方法以达托霉素和一些杂质为对照品，采用高效液相色谱法进行测定。色谱条件为色谱柱：Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5µm，流速：1.0ml/min，检测波长：223nm，进样量：25µl，柱温：25，梯度洗脱的流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调pH至3.1，流动相B：乙腈。结果使达托霉素的线性、精密度、准确度等达到了要求。关键词 含量,有关物质,线性,精密度,准确度,耐用性 目录 摘要3一、仪器与药品5二、方法建立与方法描述5 (一)、方法建立5 （二）、方

2、法描述5三、验证内容7（一）系统适应性7（二）降解实验8（三）专属性8（四）定量限LOQ和检测限LOD9（五）线性12（六）相对校正因子的计算18（七） 精密度18（八）准确度23（九）溶液稳定性26（十）耐用性28 四、结论29五、典型图谱30六、参考文献30一、仪器与药品电子分析天平XP205已校正高效液相色谱仪Agilent 1200已校正磷酸二氢铵分析纯上海光铧科技有限公司 20121215乙腈色谱纯Merck UN1648注射用水每日更新本厂自制纯化水每日更新本厂自制达托霉素对照品P1301，94.7%本实验室内部标定水解物P1301，91.4%本实验室内部标定-异构体P1301，7

3、1.9%本实验室内部标定脱水物P1301，86.6%本实验室内部标定达托霉素样品S130301浙江海正药业股份有限公司生产二、方法建立与方法描述（一）、方法建立 袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS(250×4.6mm,5.0m);梯度洗脱的流动相A:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(30:70),流动相B:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液(70:30);流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想，因此，把磷酸二氢

4、铵缓冲盐的PH值调整为3.1，梯度也有相应的调整，检测波长使通过二极管阵列检测器(DAD)检测，在190nm360nm区间进行DAD全波段扫描。通过DAD扫描结果显示样品在223nm附近具有最大吸收，综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。由于达托霉素的分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5µm色谱柱。（二）、方法描述含量色谱柱：Phenomenex IB-SIL C8 4.6×250mm 5µm流速：1.0ml/min检测波长：223nm进样量：25µl柱温：

5、25进样器温度：28流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调节pH至3.1流动相B：乙腈流动相：梯度洗脱A(%)B(%)067.532.54560405050505550505667.532.56067.532.5稀释剂：注射用水标准溶液：精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。样品溶液：精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。系统适应性：连续注射5针标准溶液，计算峰面积RSD不大于2.0%。用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量： 湿计含量%=ru×Cs×P&#

6、215;100%rsCu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度（mg/ml）rs是标准溶液所对应的主峰峰面积 ru为样品溶液所对应的主峰峰面积 P为对照品的含量，%无水无残溶含量计算公式：干计含量%=湿计含量%1-水分%-残溶%限度：以无水无溶剂计算，达托霉素中C72H101N17O26含量应93.0%。有关物质色谱条件和样品溶液同含量。1%对照溶液：精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含量： 含量%=ru×Cs×P×100%rsCu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与1.0%

7、对照溶液的配制浓度（mg/ml）rs是1.0%对照溶液所对应的主峰响应值 ru为样品溶液中各杂质对应的峰响应值 P为对照品的含量，%限度：脱水达托霉素1.5%，异构体杂质 0.7%，水解物0.4%，杂质1（RRT约为0.79） 0.2%，杂质2 （RRT约为0.92） 0.2%，杂质3 （RRT约为0.94）(C9) 0.6%，杂质4（RRT约为0.96） 0.5%，杂质5（RRT约为1.07）（C11） 0.7%，杂质6组（RRT约为1.201.25）0.6%单个未知杂质0.1%，总杂质5.0%三、验证内容（一）、系统适应性系统适应性溶液：精密称取达托霉素对照品P1301 25.01mg和2

8、5.11mg，分别置于2个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，作为STD1溶液和STD2溶液。当色谱系统平衡后，分别进1针空白溶液、进样5针STD1溶液和2针STD2溶液，计算RSD%和回收率，结果见表1。表1. 系统适应性结果STD1的RSD: 2.0%STD2回收率：98.0102.0%序号STD1峰面积STD2峰面积1st22610.222805.02nd22600.922695.43rd22595.2/4th22593.9/5th22555.1/平均值22591.122750.2RSD(%)0.090.34回收率(%)100.30结论：STD1的RSD%为0.09%，STD2的

9、RSD%为0.34%，回收率为100.30%，均满足认可标准，系统适应性良好。（二）、降解实验通过对样品溶液及各种强降解条件下的产物使用DAD 检测器进行分析，判断方法的专属性及稳定性指示性。 表2 降解试验结果 溶液名称新增杂质相对保留时间(RRT) 酸解0.2424、0.2513、0.3534、0.4689、0.6032、0.6936、0.7222、0.7858、0.8761、1.5221、1.6449、1.6729碱解0.4689、0.6147、0.7766、1.1375、1.4352、1.5695氧化0.2424、0.2626、0.2899、0.3358、0.3833、0.3952、0

10、.4294、0.5144、0.5612、0.6032、0.6531、0.6936、0.7276、0.7858、1.0891、1.4950、1.5221、1.5271、1.5372、1.5459、1.5588、1.5695、1.5727、1.6207、1.6263光照0.1669、0.1715、0.1777、0.1968、0.2076、0.2178、0.2513、0.3063、0.5144、0.5612、0.6032、0.6302、0.6531、0.6936、0.7222、0.7766、1.5221、1.5459、1.5588、1.6207避光0.6032、1.5221加热0.6032、0.69

11、36、0.7766、0.7858、0.9771、1.0891、1.1375、1.3630、1.4462、1.4649、1.4950、1.5221、1.5459、1.5695、1.6609、1.6729、1.6972高湿0.5612、0.6032、0.6302、0.6936、0.7858、1.1375、1.5221、1.5459、1.5695、1.6207、1.6729（三）、专属性水解物单个专属性溶液：精密称取水解物P1301 5.327mg于50ml容量瓶中，用乙腈：水=1：1溶解并定容至刻度。-异构体单个专属性溶液：精密称取-异构体P1301 5.930mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解

12、并定容至刻度。脱水物单个专属性溶液：精密称取脱水物P1301 5.380mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。达托霉素样品溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.78mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。混合溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.85mg于50ml容量瓶中，分别加入各单个专属性溶液5.0ml，用稀释剂溶解并定容至刻度。分别进样空白溶液、各单个专属性溶液和混合溶液，考察空白溶液在各组分保留时间处是否存在干扰，相邻各组分间分离度，结果见表3。表3 专属性理论塔板数2000相邻组分间分离度1.0水解物-异构体达托霉素脱水物单个组分保留时间(m

13、in)29.69731.78335.06839.943混合溶液各组分保留时间(min)29.72531.77734.77640.028相对保留时间(RRT)0.850.911.01.15与相邻前一个色谱峰间分离度1.081.521.831.11与相邻后一个色谱峰间分离度1.731.363.002.72理论塔板数29805324872531644523结论：各组分间分离度和理论塔板数均满足认可标准，专属性良好。（四）、定量限LOQ和检测限LOD1、定量限LOQ（1）、未知杂质定量限标准溶液：精密称取达托霉素对照品P1301 25.39mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。1.0%对照

14、溶液：精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。未知杂质LOQ溶液：精密移取1.0%对照溶液1.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-1。表4-1 未知杂质LOQ检测结果LOQ浓度 序号峰面积S/N未知杂质Conc:0.0721µg/ml相当于主峰浓度0.0144%1st4.5024212.02nd4.2026212.53rd4.1650712.14th4.3808912.35th4.2409511.06th4.3401213.7平均值4.30535/RSD%2.94/RSD%

15、5.0%，信噪比S/N：1015，LOQ 0.05%结论：未知杂质LOQ浓度为0.0721µg/ml，峰面积RSD%为2.94%，信噪比均在1015，均满足认可标准。（2）、已知杂质定量限水解物储备溶液：精密称取水解物P1301 9.736mg于50ml容量瓶中，用乙腈：水=1：1溶解并定容至刻度。水解物定量限储备溶液：精密移取水解物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。-异构体储备溶液：精密称取-异构体P1301 9.011mg于20ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。-异构体定量限储备溶液：精密移取-异构体储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂

16、定容至刻度。脱水物储备溶液：精密称取脱水物P1301 13.584mg于20ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。脱水物定量限储备溶液：精密移取脱水物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。已知杂质定量限溶液：分别精密移取水解物定量限储备溶液8.0ml、-异构体定量限储备溶液5.0ml、脱水物定量限储备溶液3.5ml，置于同一100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-24-4。表4-2 水解物LOQ检测结果LOQ浓度 序号峰面积S/N水解物Conc:0.0712µg/ml相当于主峰浓度0.014

17、2%1st2.9821110.82nd3.0032710.63rd3.0117710.34th3.0667410.25th3.0389811.36th2.8534912.0平均值2.99273/RSD%2.48/RSD% 5.0%，信噪比S/N：1015，LOQ 0.05%表4-3 -异构体LOQ检测结果LOQ浓度 序号峰面积S/N-异构体Conc:0.0810µg/ml相当于主峰浓度0.0162%1st3.2205611.32nd3.1945812.13rd3.4346911.54th3.2900110.85th3.1006912.46th3.1488213.2平均值3.23156

18、/RSD%3.67/RSD% 5.0%，信噪比S/N：1015，LOQ 0.05%表4-4 脱水物LOQ检测结果LOQ浓度 序号峰面积S/N脱水物Conc:0.1029µg/ml相当于主峰浓度0.0206%1st3.9115812.02nd3.8387612.73rd4.0840512.44th3.9907612.25th3.9684313.76th4.0102214.8平均值3.96730/RSD%2.13/RSD% 5.0%，信噪比S/N：1015，LOQ 0.05%结论：水解物LOQ浓度为0.0712µg/ml，峰面积RSD%为2.48%；-异构体LOQ浓度为0.08

19、10µg/ml，峰面积RSD%为3.67%；脱水物LOQ浓度为0.1029µg/ml，峰面积RSD%为2.13%，信噪比S/N均在1015，均满足认可标准。2、检测限LOD（1）、未知杂质检测限未知杂质检测限溶液：精密移取未知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射2针检测限溶液，计算信噪比S/N，结果见表4-5。表4-5 未知杂质检测限结果LOD浓度序号峰面积S/NConc:0.0216µg/ml相当于主峰浓度0.0043%1st1.316583.42nd1.234013.1平均值1.27530/S/N：25结论：未知杂质LOD浓

20、度为0.0216µg/ml，信噪比S/N均在25，满足认可标准。（2）、已知杂质检测限已知杂质检测限溶液：精密移取已知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射2针检测限溶液，计算信噪比S/N，结果见表4-64-8。表4-6 水解物检测限结果LOD浓度序号峰面积S/NConc:0.0214µg/ml相当于主峰浓度0.0043%1st0.6987582.52nd0.8827162.6平均值0.790737/S/N：25表4-7 -异构体检测限结果LOD浓度序号峰面积S/NConc:0.0243µg/ml相当于主峰浓度0.0049%1st

21、1.245393.42nd1.112543.4平均值1.17897/S/N：25表4-8 脱水物检测限结果LOD浓度序号峰面积S/NConc:0.0309µg/ml相当于主峰浓度0.0062%1st0.9491852.82nd1.261792.7平均值1.10549/S/N：25结论：水解物LOD浓度为0.0214µg/ml，-异构体LOD浓度为0.0243µg/ml，脱水物LOD浓度为0.0309µg/ml，信噪比S/N均在25，均满足认可标准。（五）、线性（1）、含量线性200%线性储备液：精密称取达托霉素对照品P1301 49.21mg于50ml容

22、量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。线性溶液：精密移取200%线性储备液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml，分别置于5个10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，即得到40%、80%、100%、120%、160%线性溶液。每份溶液进样2针，记录数据，做线性回归曲线，求相关系数R、截距百分比（截距/100%含量浓度对应的峰面积×100%）。结果见表5-1。表5-1. 达托霉素含量线性结果R 0.999截距百分比 3.0%浓度(mg/ml)峰面积平均峰面积40%溶液0.18648811.596688793.046398774.4960980%溶液0.372817491.

23、217464.617438.0100%溶液0.466022034.822031.222027.6120%溶液0.559226455.826450.726445.5160%溶液0.745635709.735704.935700.0线性方程Y=48119x-341.5相关系数RR=0.9999截距百分比1.55%图1. 达托霉素含量线性结论：达托霉素含量线性曲线相关系数R=0.9999，截距百分比1.55%，线性方程Y=48119x-341.5，在0.18640.7456mg/ml浓度范围内线性关系良好。（2）、未知杂质线性以未知杂质的限度0.5%(2.5µg/ml)对应的浓度为100%

24、。标准溶液和未知杂质定量限溶液：同“未知杂质定量限”项下“标准溶液和未知杂质定量限溶液”。未知杂质线性储备溶液：精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。未知杂质线性溶液：精密移取未知杂质线性储备溶液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml，分别置于6个10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，即得到40%、80%、100%、120%、160%、200%线性系列溶液。每份溶液进样2针，记录数据，做线性回归曲线，求相关系数R、截距百分比（截距/100%含量浓度对应的峰面积×100%）。结果见表5-2。表5-2. 未知杂质线性结果R

25、0.99截距百分比 15.0%浓度(µg/ml)峰面积平均峰面积LOQ溶液0.07213.856453.851133.8458040%溶液0.961845.1417144.4716043.8014880%溶液1.923589.0286388.4964287.96421100%溶液2.4044110.87798110.74789110.61780120%溶液2.8853135.99603135.44470134.89336160%溶液3.8471179.34697179.50304179.65910200%溶液4.8089232.37053231.83741231.30428线性方程相

26、关系数RR=0.9995截距百分比1.79%图2 未知杂质线性曲线结论：达托霉素未知杂质线性曲线相关系数R=0.9995，截距百分比为1.79%，线性方程Y=47.815x-1.9822，在0.07214.8089µg/ml浓度范围内线性关系良好。（3）、已知杂质线性杂质储备溶液：同“已知杂质定量限”项下“各杂质储备溶液”的配制。已知杂质定量限溶液：同“已知杂质定量限”项下“已知杂质定量限溶液”的配制。1000%线性储备溶液：分别精密移取水解物储备溶液10.0ml、-异构体储备溶液7.0ml、脱水物储备溶液10.0ml，置于同一100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。已知杂质线性溶液

27、：精密移取1000%线性储备溶液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml，分别置于6个50ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，即得到40%、80%、100%、120%、160%、200%线性系列溶液。每份溶液进样2针，记录数据，做线性回归曲线，求相关系数R、截距百分比（截距/100%含量浓度对应的峰面积×100%）。结果见表5-35-5。表5-3. 水解物线性结果R 0.99截距百分比 15.0%浓度(µg/ml)峰面积平均峰面积LOQ溶液0.07123.438703.273983.1092640%溶液0.711935.1477635.4013

28、235.6548780%溶液1.423870.3083370.7704071.23246100%溶液1.779789.2334588.6593388.08520120%溶液2.1357104.00508103.48459102.9641160%溶液2.8476138.96315138.82312138.68309200%溶液3.5595168.99667168.63343168.27019线性方程Y=47.613X+1.7836相关系数RR=0.9995截距百分比2.01%图3. 水解物线性曲线表5-4 -异构体线性结果R 0.99截距百分比 15.0%浓度(µg/ml)峰面积平均峰

29、面积LOQ溶液0.08103.699193.587143.4750940%溶液0.907043.807442.9410242.0746480%溶液1.814187.7002687.7794987.85872100%溶液2.2676108.70023108.26199107.82375120%溶液2.7211127.91540127.85935127.80329160%溶液3.6282171.48824171.26703171.04582200%溶液4.5352212.36913212.28187212.19461线性方程Y=46.849x+0.9338相关系数RR=0.9998截距百分比0.8

30、6%图4. -异构体线性曲线表5-5 脱水物线性结果R 0.99截距百分比 15.0%浓度(µg/ml)峰面积平均峰面积LOQ溶液0.10293.85193.964514.0771240%溶液2.3527114.03679115.81559117.5943980%溶液4.7055231.24600231.56381231.88162100%溶液5.8819279.97849277.83825275.69800120%溶液7.0582328.73428328.19989327.66550160%溶液9.4110424.52872423.97350423.41827200%溶液11.76

31、37550.04480549.88559549.72638线性方程Y=45.828X+5.666相关系数RR=0.9991截距百分比2.04%图5. 脱水物线性曲线结论：水解物线性曲线相关系数R=0.9995，截距百分比为2.01%，线性方程Y=47.613x+1.7836，在0.07123.5595µg/ml浓度范围内线性关系良好；-异构体线性曲线相关系数R=0.9998，截距百分比为0.86%，线性方程Y=46.849x+0.9338，在0.08104.5352µg/ml浓度范围内线性关系良好；脱水物线性曲线相关系数R=0.9991，截距百分比为2.04%，线性方程Y=

32、45.828x+5.666，在0.102911.7637µg/ml浓度范围内线性关系良好。（六）、相对校正因子的计算由达托霉素有关物质和药物主成分的响应值相对于浓度的线性曲线，相对校正因子可通过下式确定：相对校正因子=斜率主成分/斜率有关物质；结果见表6。表6 有关物质相对校正因子计算杂质名称线性方程斜率校正因子达托霉素47.8151.0水解物 Y=47.613X+1.783647.6131.0异构体 Y=46.849X+0.933846.8491.0脱水物Y=45.828X+5.66645.8281.0（七）、精密度 1、系统精密度 同“4.1系统适应性”。 2、方法精密度 方法精

33、密度溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.78mg、24.97mg、25.18mg、25.78mg、24.99mg、25.28mg，分别置于6个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。 由实验人员I进样，结果见表7-17-3。表7-1 精密度实验结果(外标法计算有关物质含量)主峰含量RSD% 2.0%若杂质含量在LOQ%0.1%，RSD 50%若杂质含量在0.1%0.5%，RSD 25%方法精密度操作者周荣虎仪器编号Agilent 1200 16#样品123456平均值RSD%达托霉素含量%92.2593.0992.3392.4792.3092.2692.450.35单个最大杂质

34、%0.09920.09890.10180.10090.10090.09650.09971.93杂质10.06730.06750.06700.06680.06740.06550.06691.11水解物0.07650.07680.07510.07480.07370.07490.07531.54-异构体0.32700.32810.31810.33080.32540.32310.32541.36杂质20.03520.03600.03840.03340.03620.03590.03594.50杂质30.30340.30340.28730.30460.29420.29390.29782.36杂质40.16

35、690.17020.18010.16430.17460.17360.17163.32杂质50.43380.43660.42780.43330.43540.43440.43360.70脱水物0.27040.27510.27790.27860.27770.29400.27902.85杂质6组0.58370.59250.58940.58910.58150.58110.58620.81总杂质2.86172.86972.85162.85562.83782.84822.85410.39表7-2 精密度实验结果(归一化法计算有关物质含量)主峰含量RSD% 2.0%若杂质含量在LOQ%0.1%，RSD 50%

36、若杂质含量在0.1%0.5%，RSD 25%方法精密度操作者周荣虎仪器编号Agilent 1200 16#样品123456平均值RSD%达托霉素含量%92.2593.0992.3392.4792.3092.2692.450.35单个最大杂质%0.10490.10360.10750.10640.10660.10190.10522.00 杂质10.07120.07070.07080.07050.07120.06920.07061.05水解物0.08090.08040.07930.07890.07780.07920.07941.39-异构体0.34560.34360.33590.34880.3437

37、0.34150.34321.26杂质20.03730.03770.04050.03520.03820.03790.03784.50 杂质30.32070.31780.30340.32110.31080.31060.31412.22杂质40.17640.17820.19020.17330.18440.18350.1813.41杂质50.45850.45730.45170.45680.460.4590.45720.64脱水物0.28580.28810.29350.29370.29340.31070.29422.97杂质6组0.61690.62060.62240.62120.61440.61420.

38、61830.58总杂质3.02433.00573.01133.01122.99793.00993.01010.29表7-3 各杂质归一化和外标法12针结果若杂质含量在LOQ%0.1%，12针RSD 50%若杂质含量在0.1%0.5%，12针RSD 25%归一化和外标法12针含量平均值(%)12针RSD(%)单个最大杂质%0.10223.34杂质10.06902.60水解物0.07802.17-异构体0.33512.67杂质20.03654.87杂质30.30872.36杂质40.17404.86杂质50.44552.78脱水物0.28234.87杂质6组0.60103.03总杂质2.93592

39、.65结论：6针精密度溶液，主峰和各杂质含量RSD%均满足认可标准，精密度良好。用外标法和归一化法分别计算达托霉素各杂质含量，结果无明显偏差。（3）、中间精密度 中间精密度溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.07mg、26.05mg、25.71mg、25.46mg、24.63mg、25.78mg，分别置于6个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。 由实验人员II在另外一台机器上进样，结果见表7-47-6。表7-4 中间精密度实验结果(外标法计算有关物质含量)主峰含量RSD% 2.0%若杂质含量在LOQ%0.1%，RSD：£ 50%若杂质含量在0.1%0.5%，RSD

40、：£ 25%中间精密度操作者郭红兵仪器编号Agilent 1200 15#样品123456平均值RSD%达托霉素含量%93.0392.3892.2292.2392.1192.5992.430.37单个最大杂质%0.09840.09650.09820.10110.10080.10170.09952.06杂质10.06640.06220.06260.05950.06320.06290.06283.52水解物0.08830.08690.08720.09360.09250.08920.08963.13-异构体0.34090.32220.32320.32520.32360.34090.3293

41、2.74杂质20.05660.05360.05490.05510.05540.05570.05521.79杂质30.33590.32250.33590.33230.32750.32800.33041.61杂质40.16210.16440.15800.16070.16580.15900.16171.88杂质50.44790.44480.44420.44320.44570.44600.44530.37脱水物0.27160.28190.28860.28690.27970.28700.28262.26杂质6组0.61030.60080.60690.60410.60370.60660.60540.54总

42、杂质3.13863.07923.11163.11613.12353.15093.12000.79表7-5 中间精密度实验结果(归一化法计算有关物质含量)主峰含量RSD% 2.0%若杂质含量在LOQ%0.1%，RSD：£ 50%若杂质含量在0.1%0.5%，RSD：£ 25%中间精密度操作者郭红兵仪器编号Agilent 1200 15#样品123456平均值RSD%达托霉素含量%93.0392.3892.2292.2392.1192.5992.430.37单个最大杂质%0.10550.10420.10630.10940.10920.10950.10742.15杂质10.071

43、20.06720.06770.06430.06840.06780.06783.27水解物0.09470.09390.09440.10120.10020.09610.09683.27-异构体0.36560.34810.34960.35170.35040.36720.35542.42杂质20.06070.0580.05940.05950.060.060.05961.53杂质30.36020.34850.36340.35940.35460.35330.35661.52杂质40.17380.17760.17090.17380.17950.17130.17451.97杂质50.48030.48060.4

44、8060.47940.48270.48040.48070.23脱水物0.29120.30450.31220.31030.30280.30910.3052.51杂质6组0.65430.64910.65660.65330.65360.65330.65340.37总杂质3.36543.32673.36593.37033.38223.39383.36740.68表7-6 精密度和中间精密度12份样品结果主峰含量RSD% 2.0%若杂质含量在LOQ%0.1%，RSD：£ 50%若杂质含量在0.1%0.5%，RSD：£ 25%外标法含量(%)RSD(%)归一化法含量(%)RSD(%)达

45、托霉素92.440.34/单个最大杂质%0.09961.900.10632.26杂质10.06494.100.06923.12水解物0.08259.400.088110.59-异构体0.32742.160.34932.61杂质20.045522.410.048723.53杂质30.31415.730.33536.85杂质40.16664.070.17773.29杂质50.43941.490.46892.65脱水物0.28082.540.29963.22杂质6组0.59581.800.63582.92总杂质2.98704.693.18875.87结论：6针中间精密度溶液，主峰和各杂质含量RSD%

46、均满足认可标准；精密度和中间精密度12份样品溶液，主峰和各杂质含量RSD%均满足认可标准，中间精密度良好。用外标法和归一化法分别计算达托霉素各杂质含量，结果无明显偏差。（八）、准确度 1、含量准确度80%溶液：精密称取达托霉素对照品P1301 20.02mg、20.57mg、21.16mg，分别置于3个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。100%溶液：精密称取达托霉素对照品P1301 25.13mg、24.58mg、25.09mg，分别置于3个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。120%溶液：精密称取达托霉素对照品P1031 29.94mg、29.65mg、30.92mg，分别

47、置于3个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。每份溶液进样1针，记录数据，计算回收率，结果见表8-1。表8-1 含量准确度检测结果平均回收率：98.0102.0%RSD：2.0%浓度水平峰面积检出量(mg/ml)加入量(mg/ml)回收率(%)平均值(%)RSD(%)80%溶液117740.20.37200.379298.1098.500.40218302.60.38380.389698.51318902.30.39630.400898.88100% 溶液122475.00.47130.476099.0198.790.43221825.20.45760.465598.30322455.4

48、0.47080.475299.07120%溶液126568.50.55710.567198.2498.610.33226440.60.55440.561698.72327613.10.57900.585698.87结论：含量准确度实验从80%120%，回收率和RSD%均满足认可标准。（2）、未知杂质准确度未知杂质定量限溶液：同“未知杂质定量限”项下“未知杂质定量限溶液”。未知杂质准确度储备溶液：同“未知杂质线性”项下“未知杂质线性储备溶液”。100%未知杂质准确度溶液：精密移取未知杂质准确度储备溶液5.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。140%未知杂质准确度溶液：精密移取未知杂质准

49、确度储备溶液7.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。每份溶液平行配制3份，记录数据，计算回收率，结果见表8-2。表8-2 未知杂质准确度检测结果LOQ平均回收率：50%150% ，其它点平均回收率：75%125%RSD不超过10%浓度水平峰面积检出量(µg/ml)加入量(µg/ml)回收率(%)平均值(%)RSD(%)LOQ溶液13.620890.07470.0721103.61105.922.3023.787610.0782108.4633.691090.0762105.69100% 溶液1109.928082.26852.404494.3595.651.412111.327512.297395.553113.069122.333397.04140%溶液1155.154103.20173.366295.1195.150.732156.364933.2267