鸡卵类粘蛋白提取

1、鸡卵类粘蛋白提取摘要：本实验利用蛋白质在等电点处会沉淀和丙酮分级沉淀的特征，对样品进行粗处理。在对处理过的样品进行细分离，其方法是凝胶过滤。最后通过SDSPAGE电泳对粗样品进行细分离和对样品的分子量进行分析。有实验可得鸡卵类粘蛋白的分子质量为32187Da。关键词：鸡卵类粘蛋白，凝胶过滤，SDSPAGE第一章 前言1.1 鸡卵类粘蛋白的介绍鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用与胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效分离与纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白是至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈现不均一性。目前至少已经获

2、得4种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶的性质上和氨基酸的组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖蛋白部分（主要是D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差别。它们的等电点有一定的范围，是在。相对分子量28000。鸡卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高溶度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度比较高时迅速失活。鸡卵类粘蛋白除对猪和牛的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定程度上的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。1.2 对样品前处理的原理先由鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获

3、得粗品，经分离从而获得粗品。1.3 凝胶过滤的原理凝胶过滤也称为排阻层析，分子筛层析和凝胶层析。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有许多细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应，当凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后转入到层析柱内，加入欲分离的混合物，再以同一洗脱液洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而在凝胶颗粒的空隙最先流出柱外，而小分子物质可以进入凝胶颗粒的内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质按照顺序分离开。1.4 SDS-PAGE测定鸡卵类粘蛋白的分子量SDS-PAGE是在要将进行电泳的样品中加入含有SDS和-巯基

4、乙醇的样品处理液，SDS即为十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水中处理3-5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。有上述可以知道，在SDS

5、-PAGE电泳中蛋白质就按分子量的大小分离出来。第二章 鸡卵类粘蛋白的粗提取2.1 试剂与仪器试剂：鸡蛋，丙酮，TCA-丙酮：34.5g三氯乙酸溶于38.3ml蒸馏水，再加入100.5ml丙酮配成150mlTCA-丙酮溶液，5mol/L NaOH，5mol/L HCl。仪器：低速离心机和高速冷冻离心机，水浴锅，真空干燥仪。2.2 实验步骤1.取一只鸡蛋，先讲蛋的一端开一个小洞，然后将蛋放在100ml量筒上，再将蛋的另一端也开一个小洞，蛋清就会流入100ml量筒的里，取45ml蛋清倒入100ml小烧杯里。2.25-30水浴下不断搅拌，慢慢加入等体积TCA-丙酮溶液，此时其pH约为1.5。用5mo

6、l/LNaOH将pH调至3.5，调至3.5后，继续搅拌30min。4静止80min，3000rpm离心30min，取上清。边搅拌上清加入4倍体积的预冷的丙酮，4静止80min，掉到部分上清，3000rpm离心15min，取沉淀真空干燥。第三章 凝胶过滤层析法纯化鸡卵类粘蛋白3.1试剂与仪器试剂：葡聚糖凝胶G-100，pH6.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）。仪器：电子天平，离心机，柱层析系统：层析柱，核酸蛋白检测仪，部分收集器，微量泵，记录仪。3.2实验步骤1.装柱：装柱前，必须用真空干燥器抽空凝胶中的空气，并将凝胶上面的多余的水倒掉，并且柱子底部要留一点水。2.平衡：用pH6.5

7、的0.02mol/LPBS平衡柱子，平衡是的流速为0.7-0.8ml/min。平衡要充分，否则会影响分离效果。3.样品处理：取鸡卵类粘蛋白粗制品60-80mg，放入10ml试管中，用0.7ml的PBS溶解，用玻璃棒搅匀后，转移至1.5ml小离心管中，3000rpm离心5min，取上清为样品。4.上样：把样品加入到层析柱中。5.洗脱：用PBS进行洗脱，用蓝色葡聚糖和铬酸钾来测出柱子的外水体积和内水体积。7.绘制洗脱曲线。第四章 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定鸡卵类粘蛋白的分子质量4.1 试剂与仪器试剂：低分子量分子标准蛋白。10%SDS溶液，10%TEMED，10%AP，样

8、品缓冲液，10mmol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，凝胶贮液，凝胶缓冲液，固定脱色剂，染色液脱色液。仪器：直流稳压电泳仪，垂直平板电泳槽，凝胶成像系统。4.2 实验步骤1.配胶 分离胶（t=12%） 浓缩胶dH2O 3.2ml dH2O 3.2ml pH8.8缓冲液 2.5ml pH8.8缓冲液 2.5ml10%SDS 0.1ml 10%SDS 0.1mlAcr/Bis 4.0ml Acr/Bis 4.0ml 10AP 60ul 10AP 60ul10%TEMED 60ul 10%TEMED 60ul总体积 10ml 总体积 10ml2.样品处理：称取鸡卵类粘蛋白10-20mg，用蒸馏

9、水溶于10ml试管中，使其浓度为50mg/ml，称取鸡卵类粘蛋白15ul，放入1ml离心管中，在加入30ul样品缓冲液，沸水煮加热3-5min。3.点样：用微量玻璃针加样，每个孔加入20ul。4.电泳：开始电泳时的电流为15mA，待样品进入分离胶是，电流改为20mA，当溴酚蓝前面距分离胶0.4厘米时，停止电泳。5.凝胶分离：点用结束时，取下凝胶模，用塑料或不锈钢药勺小心撬开分离胶的胶板，在用塑料小心把凝胶从胶板上取下来，直接放入含有固定染色液中。6.固定染色：先用固定脱色液固定20min，在用染色液染色30mim。7.用固定脱色液脱色，没40min换脱色液，换两次过夜，第二天观察。第五章 结果

10、分析5.1凝胶过滤结果分析图1 凝胶过滤层析洗脱图从图中可以看出，前面两个锋为蓝色葡聚糖的洗脱锋，也就是外水体积V0，当时的洗脱流速为10min收集1ml，所以可知，外水体积是：40min×1ml/min=40ml。第二个锋是重铬酸钾的洗脱锋，是床体积VT，所以其床体积为：140min×1ml/min=120ml。由于凝胶的型号不是葡聚糖凝胶G-100的所以导致不能很好分离出鸡卵类粘蛋白。从图中可以推断出所用的凝胶可能是G-50或者是交联度更大的凝胶。5.2 SDS-PAGE结果分析图2 SDS-PAGE电泳分离图 兔磷酸化酶BSA兔肌动蛋白牛磷酸酐酶胰蛋白酶抑制剂溶菌酶长

11、度(cm)1.282.503.194.465.906.25迁移率0.20450.39940.50960.71250.94250.9984分子量974006620043000310002010014400分子量对数4.98864.82094.63354.49144.30324.1584表1 各种标准蛋白的迁移率图3 标准曲线由电泳可以测定，样品的长度为4.11cm，迁移率为0.6563，求的分子量对数为4.5377，分子量为32187Da。第六章 讨论 取鸡蛋清是应防治吸入蛋黄，要保证只是蛋清。因为掺了蛋黄就会引入一些杂蛋白，会影响后续的实验。在操作中要时刻注意记录数据。凝胶过滤一定要把凝胶的型号选择正确，要不然无法分离出有效成分。在SDS-PAGE凝胶电泳过程中，一定要使样品梳垂直平稳拔出，梳底需水平。在加样时，用微量取样器吸取已处理好的样品201(由于样品需分别单个加入胶孔,而只用1支微量取样器,则在加入第1个样品后,应洗净后才能吸取第2个样品,以免相互污染)。将取样器针头穿过凝胶孔上的缓冲液,使样品落在凝胶面上,推取样器时要慢,用力过猛会使