第11周实验5目的片段的回收

1、实验四、目的片段的回收实验四、目的片段的回收配制配制1.5%的琼脂糖凝胶，选择较大的梳子（上样量约为的琼脂糖凝胶，选择较大的梳子（上样量约为110ul）。）。注意：1、使用新鲜配制的TBE缓冲液和新配制的琼脂糖凝胶。2、三孔的回收胶梳子，其中两孔分别能上样约100ul，中间 小孔（或边上）上样Marker.(4人/块，倒胶约30ul)。3、14孔梳子，上样量约40-50ul。倒胶约60ul。时间安排：时间安排：周四下午（晚上）：配回收胶，电泳，切胶称重周四下午（晚上）：配回收胶，电泳，切胶称重周五上午（下午）：用凝胶试剂盒回收目的片段周五上午（下午）：用凝胶试剂盒回收目的片段学习掌握从琼脂糖凝

2、胶电泳中回收学习掌握从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段片段一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，像用于凝胶的再溶化，像NaClO4（高氯酸钠）能用于凝胶的裂解，一般的凝（高氯酸钠）能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。试剂盒采用经典的硅胶膜技术，其纯胶回收试剂盒利用的也是这一原理。试剂盒采用经典的硅胶膜技术，其纯化原理是含有目的片段的琼脂糖凝胶溶解后，硅胶膜柱在高盐和低化原理是含有目的片段的琼脂糖凝胶溶解后，硅胶膜柱在高盐

3、和低pH值条值条件下高效可逆的吸附体系中的件下高效可逆的吸附体系中的DNA片段，蛋白及其他杂质不被吸附而被除片段，蛋白及其他杂质不被吸附而被除去，被吸附的去，被吸附的DNA片段在低盐和高片段在低盐和高pH值条件下再被洗脱纯化。值条件下再被洗脱纯化。四、仪器设备四、仪器设备五、实验用具五、实验用具电泳仪电泳仪 微型电泳槽微型电泳槽 紫外透射检测仪紫外透射检测仪 恒温金属浴恒温金属浴冰冰盒盒 微量微量离心管离心管 移液移液器器 手术刀手术刀微量离心管微量离心管（1.5 ml 1） 吸管头若干吸管头若干三、实验三、实验材料材料上次实验课上次实验课Hind III酶切的酶切的MP3质粒质粒六、试剂六、

4、试剂琼脂糖0.5TBE电泳缓冲液 10 载样缓冲液 （loading buffer） GoldView I型核酸染色剂 （10000 ） DNA分子量标准（DNA marker）：Marker IIIDNA凝胶回收试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）凝胶回收试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）七、实验步骤七、实验步骤1、配制配制1.5%的琼脂糖凝胶，选择较大的梳子。的琼脂糖凝胶，选择较大的梳子。2、酶切酶切MP3质粒的电泳分离（使用新的电泳缓冲液）。质粒的电泳分离（使用新的电泳缓冲液）。3、切取含有目的切取含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶条带（片段的琼脂糖凝胶条带（800-900 bp条带）。条带）

5、。4、其余步骤按照试剂盒说明书进行。、其余步骤按照试剂盒说明书进行。1200bp800bpMarker III酶切后的MP3试剂盒操作步骤试剂盒操作步骤1、切取含有目的、切取含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶条带（切下后切成小块），放入一片段的琼脂糖凝胶条带（切下后切成小块），放入一个称重过的个称重过的1.5 ml离心管里，离心管里，称取凝胶的重量近似的确定其体积称取凝胶的重量近似的确定其体积。2、按照每、按照每100 mg琼脂糖凝胶对应琼脂糖凝胶对应100 l 溶液溶液BD的比例，向离心管中加入溶的比例，向离心管中加入溶液液BD。3、55-65恒温金属浴上温育凝胶恒温金属浴上温育凝胶7-10 m

6、in7-10 min，直至凝胶完全溶化，期间需要，直至凝胶完全溶化，期间需要振荡混合振荡混合3 3次。次。4、待溶解后的凝胶溶液降至室温时，将其置于、待溶解后的凝胶溶液降至室温时，将其置于DNA纯化柱中，静置纯化柱中，静置2 min。5、12000 rpm离心离心1 min，若溶液量大于，若溶液量大于DNA纯化柱的容积（纯化柱的容积（700 l ），可），可分两次离心，弃滤液。分两次离心，弃滤液。6、加入、加入500 l 溶液溶液PE，12000 rpm离心离心1 min，弃滤液。重复此步骤一次。弃滤液。重复此步骤一次。7、 12000 rpm离心离心3 min，以彻底去除纯化柱中的液体，以彻底去除纯化柱中的液体。8、将、将DNA纯化柱置于新的纯化柱置于新的1.5 ml离心管里，向纯化柱的中央悬空滴加离心管里，向纯化柱的中央悬空滴加30 l 溶液溶液Eluent（60预热预热），静置），静置2 min， 12000 rpm离心离心1 min，管底溶液，管底溶液即为回收的目的即为回收的目的DNA片段。之后将片段。之后将DNA储存于储存于-20 保存备用。保存备用。注意事项注意事项1、电泳时要试用新鲜配制的TBE缓冲液和新配制的琼脂糖凝胶。2、 挖含目的DNA的凝