不同转染方法转染牛体细胞效率的比较

1、农业生物技术学报,2011年,第19卷,第6期,第10271033页Journal of Agricultural Biotechnology,2011,Vol.19,No.6,10271033研究报告A Letter不同转染方法转染牛体细胞效率的比较李松丁方荣戴蕴平*朱士恩*中国农业大学动物科技学院,中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京济普霖生物技术有限公司,北京100193*通讯作者,daiyunping;zhushien摘要为了从新转染方法与传统转染方法的比较中找出更为高效的转染方法,本研究以绿色荧光蛋白(GFP质粒DNA为外源基因,分别采用核转染法、电穿孔法和脂质体法转染牛的3

2、种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞。针对不同类型的细胞,实验首先对核转染法和电穿孔法的转染参数进行了系统的摸索和优化,然后将优化后的核转染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一致的情况下进行了转染对比实验,分析比较了转染48h后的绿色荧光比率和细胞存活率。结果显示,核转染法转染胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞的优化程序分别是V013、T023和U023;在电穿孔法中,当电场强度为90V/mm,脉冲时间为10ms时,胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的转染效率最高,胎儿输卵管上皮细胞则在电场强度为80V/mm,脉冲时间为5ms时获得了最佳转染效率

3、;最后通过转染对比实验得出,核转染法在3种细胞中都获得了最高的转染效率,分别为(98.78±0.30%、(88.43±2.10%和(71.31±0.77%,均显著高于电穿孔法和脂质体法;转染后的存活率则为脂质体法最高,电穿孔法最低。研究结果说明,核转染法可以成为一种结合牛体细胞克隆技术生产转基因牛更有效的转染方法。关键词细胞转染,核转染法,电穿孔法,脂质体法,牛体细胞Comparison of Different Methods for Transfection Efficiency of Bovine Somatic CellsLi Song Ding Fang

4、rong Dai Yunping*Zhu Shien*Animal Sci-tech College,State Key Laboratory for Agrobiotechnology,China Agricultural University,Geneprint Biotechnology Co.LTD,Beijing 100193,China*Corresponding author,daiyunping;zhushienDOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2011.06.007Abstact The objective of this study was to f

5、ind a more efficient transfection method between a new transfection method and the traditional transfection methods.Three types of bovine donor cells(fetal fibroblast cells,fetal oviduct epithelial cells and cumulus granulosa cellsthat commonly used for nuclear transfer were transfected with plasmid

6、 DNA of green fluorescent protein(GFPgene using the nucleofection,electroporation and lipofection.We firstly determined optimal transfection parameters for nucleofection and electroporation,then transfection experiments were carried out to compare efficiency of optimized nucleofection and electropor

7、ation with lipofection under identical conditions,and green fluorescence ratio and cell survival were assessed48h after transfection.The results showed that the optimization program of nucleofection for fetal fibroblasts,fetal oviduct epithelial cells and cumulus granulosa cells were V013,T023and U0

8、23;In electroporation,when the electric field was90V/mm,pulse duration was10ms,fetal fibroblasts and cumulus granulosa cells got the highest efficiency, while parameters of80V/mm and5ms were good for fetal oviduct epithelial cells;Finally,after transfection comparision experiments,the nucleofection

9、demonstrated the highest transfection efficiency of(98.78±0.30%、DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2011.06.007基金项目:本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(No.2008ZX08007-001资助收稿日期:2011-05-16接受日期:2011-08-03农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology(88.43±2.10%and(71.31±0.77%respectively in all three types o

10、f cells,were significantly higher than electroporation and lipofection;and lipofection yielded the highest survival rate,electroporation got the lowest. The results demonstrate that nucleofection can be a more efficient alternative to produce transgenic cattle when combining with somatic cell clonin

11、g technology.Keywords Cell transfection,Nucleofection,Electroporation,Lipofection,Bovine somatic cells细胞转染技术是采用一定的方法和途径将外源分子如DNA、RNA等导入特定的细胞,并表达目的基因,产生特定功能的蛋白质分子。在生产转基因动物的研究中,通过结合细胞转染技术与体细胞克隆技术培育转基因动物是一条非常有效的途径,选择合适的细胞转染方法并进行优化,将会得到较高的转染效率,从而可以间接提高转基因克隆技术的效率。目前细胞转染应用最为普遍的是脂质体法(Fu et al.,2008;Iguma e

12、t al.,2005;Lee et al.,2005和电穿孔法(Lee et al.,2005;Roh et al.,2000。阳离子脂质体作为一种有效的基因传递载体具有下列特点:对细胞类型有选择性,转染效果随细胞类型变化大,对DNA的质量要求高,但操作简便,成本适中且细胞毒性低。电穿孔技术在20世纪80年代初期开始用于将DNA导人多种动物细胞,理论上可以转染几乎所有类型细胞。较之脂质体转染,电穿孔法有使用方便,转染效率高,外源基因通常以单拷贝形式整合(Boggs et al.,1986等诸多优点,但伴随较高的细胞毒性。近些年由Amaxa公司研发出的核转染技术是一种非病毒介导的新型转染技术,该

13、技术在传统电穿孔技术的基础上进行改良,设计出包含针对不同类型细胞的优化转染程序的Amaxa R Nucleofecto R 转染设备和细胞特异性核转染试剂。核转染法就是采用对特定类型细胞配套的核转染试剂和转染程序,直接把外源基因导入细胞核中,以达到最佳转染效率。与其他转染技术相比,其可以直接将DNA转染到细胞核内,实现了因受到细胞分裂限制而一直困扰人们的原代细胞的高效率转染,所以特别适用于转染原代细胞和难以转染的细胞系(Cao et al., 2009;Ganesh et al.,2003;Gresch et al.,2004;Leclere et al.,2005;Lenz et al.,2

14、003;Trompeter et al.,2003; Yin et al.,2006。目前该技术较多的应用于肿瘤研究、免疫学、组织工程学及心血管疾病研究领域中,还未见有用于牛体细胞转染的相关报道。胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞都是常用的核移植供体细胞,并且均已成功获得克隆牛(Cibelli et al.,1998;Kato et al.,2000;Zakhartchenko et al.,1999,本实验应用带有绿色荧光蛋白基因的质粒在上述三种细胞上进行转染,更系统地比较这三种转染方法的转染效率,为进一步的稳定转染、筛选转基因细胞并生产转基因克隆牛提供基础资料。1结果与分析1

15、.1牛的各种体细胞系的建立经过原代培养、继代培养、冷冻保存等体外培养操作,成功的建立了黄牛胎儿成纤维细胞系(编号LXH102FFb、奶牛胎儿输卵管上皮细胞系(编号1001FOV和黄牛卵丘颗粒细胞系(编号CC(图1。1.2核转染法转染条件的优化对LXH102FFb、1001FOV和CC的推荐核转染程序进行筛选。LXH102FFb和CC都采用程序A024、T016、U012、U023和V013转染,1001FOV采用程序S005、T013、T020、T023和U017转染,从图2可以看出,各细胞在推荐程序下转染后的存活率差异不大,以转染后48h绿色荧光细胞百分比高低为标准进行选择得出,LXH102

16、FFb、1001FOV和CC的最优转染程序分别是V013、T023和U023。LXH102FFb1001FOVCC图1牛3种体细胞系Figure1Three types of bovine somatic cells1028不同转染方法转染牛体细胞效率的比较Comparison of Different Methods for Transfection Efficiency of Bovine Somatic Cells图3不同电转参数下牛三种体细胞的转染效率和存活率Figure 3Transfection efficiency and survival rate ofLXH102FFb (A

17、,1001FOV (Band CC (Cunder different electroporation parametersA.1:140V,5ms;2:140V,8ms;3:140V,10ms;4:160V,5ms;5:160V,8ms;6:160V,10ms;7:180V,5ms;8:180V,8ms;9:180V,10msB.1:120V,1ms;2:120V,2ms;3:120V,5ms;4:140V,1ms;5:140V,2ms;6:140V,5ms;7:160V,1ms;8:160V,2ms;9:160V,5msC.1:140V,5ms;2:140V,8ms;3:140V,10ms

18、;4:160V,5ms;5:160V,8ms;6:160V,10ms;7:180V,5ms;8:180V,8ms;9:180V,10ms图2不同核转染程序下牛三种体细胞的转染效率和存活率Figure 2Transfection efficiency and survival rate of LXH102FFb (A,1001FOV (Band CC (Cunder different nucleofection procedures1.3电穿孔法转染条件的优化通过调整电脉冲时间(110ms和改变电场强度(6090V/mm来设置电转参数组合转染LXH102FFb 、1001FOV 和CC ,不同

19、参数组合下各细胞的转染效率见图3,当电压为180V ,脉冲时间为10ms 时,LXH102FFb 和CC 的转染效率最高,1001FOV 则在电压为160V ,脉冲时间为5ms 时获得了最高转染效率,为了更好的进行后面的转染对比实验,选择转染效率最高的参数组合为最优参数,尽管这些细胞在获得最高转染效率的同时存活率普遍偏低。1.4不同转染方法转染效率的比较如图4所示,在LXH102FFb 和1001FOV 的转染对比实验中,3种转染方法产生的转染效率及细胞存活率两两之间均差异显著(LXH102FFb,P <0.05;1001FOV,P <0.01,核转染法在3种细胞中都获得了最高的转

20、染效率,分别为(98.78±0.30%、(88.43±2.10%和(71.31±0.77%,均显著高于电穿孔法的(75.14±2.95%、(21.16±2.44%、(36.62±6.20%和脂质体法的(65.16±1.53%、(2.57±0.26%、(18.25±0.33%;另外,转染后各细胞的存活率则为脂质体法最高,并且与其它2种方法得到的存活率差异显著(P <0.05或P <0.01。2讨论随着科学技术的不断进步,将外源基因导入真核细胞的转染技术在生物医药研究和基因功能研究转染效率Tran

21、sfection efficiency 100806040200A024T016U012U023V013核传染程序Nucleofection programsA 百分比/%P e r c e n t a g e存活率Survival rate核传染程序Nucleofection programsS005100806040200T013T020T023U017B百分比/%P e r c e n t a g e转染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate100806040200A024核传染程序Nucleofection programsT016U012

22、U023V013C百分比/%P e r c e n t a g e转染效率Transfection efficiency 存活率Survival rateA百分比/%P e r c e n t a g e100806040200电转参数组合体(电压,脉冲时间Parameters for electroporation(voltage,pulse time转染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate123456789B百分比/%P e r c e n t a g e100电转参数组合体(电压,脉冲时间Parameters for electropora

23、tion(voltage,pulse time806040200转染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate123456789C百分比/%P e r c e n t a g e100电转参数组合体(电压,脉冲时间Parameters for electroporation(voltage,pulse time806040200转染效率Transfection efficiency 存活率Survival rate1234567891029农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology方面起着越来越重要的作用

24、,选择好的转染方法,对条件进行优化,将会得到较高的转染效率。化学转染方法经过多年的发展已经得到很好的提高,而物理转染方法的改良进展却很有限(Colosimo et al.,2000。Amaxa 公司在传统电穿孔技术的基础上加以改良形成了一种新的物理转染方法-核转染,依靠先进的电穿孔设备设定特定转染程序并结合使用配套的特异性转染液直接把外源基因导入细胞核,转染效率不受细胞分裂快慢影响,与以往的物理方法相比该方法的转染效果有了质的飞跃。从核转染仪公司的官方网站(的最优转染程序,但是本实验中的细胞系并未罗列在特定的细胞系范围内,而是作为泛指细胞类型被网站建议对多个推荐程序进行筛选。Maurisse

25、等(2010经过筛选多种转染程序发现猪胎儿成纤维细胞最优转染程序为U020,获得的转染效率是90%,兔胎儿成纤维细胞最优转染程序为U023,转染效率为38%;也有人转染猪胎儿成纤维细胞时对推荐的10个转染程序进行筛选得出最优程序U023,获得了79%的转染效率(Nakayama et al.,2007。在本实验中,首次用核转染法转染牛体细胞并筛选了转染程序,LXH102FFb 和CC 均采用成纤维细胞推荐程序A024、T016、U012、U023和V013进行转染比较和筛选,1001FOV 则从上皮细胞推荐程序S005、T013、T020、T023和U017中筛选,在优化过程中发现转染后的存活

26、率差异不大,于是选择转染后48h 绿色荧光细胞比例最高的为最优转染程序。从图2得出LXH102FFb 的最优转染程序是V013,转染效率为(96.91±1.88%,明显高于上述猪和兔成纤维细胞的转染效率,可见,不同细胞个体的优化程序和转染效率有很大的差异。而1001FOV 和CC 的最优程序分别为T023(82.92±0.31%和U023(72.70±2.57%。电穿孔法可广泛应用于各类细胞的转染(Shigekawa and Dower,1988,但好的电转参数因细胞不同而异。为达到较好的转染效果,一般考虑对电场强度和脉冲时间这两个关键因素进行优化(Rols an

27、d Teissie,1998,在众多关于牛体细胞克隆文献中(Arat et al.,2001;Forsberg et al.,2002;Gong et al.,2004;Roh et al.,2000都有报道使用电穿孔法转染,但并没有提及对电转参数的优化和对转染效率高低的评估。Jordan 等(2008对指数型电穿孔仪转染各种难转的人细胞的电击参数进行了系统的摸索和探讨,在通过转染siRNA 进行评估的过程中,人原代成纤维细胞和人静脉内皮细胞的转染效率最高达到93%和94%,当对人原代成纤维细胞转染GFP 质粒时则获得了44%的最好转染效率。Ross 等(2009在猪胎儿成纤维细胞上对方波形式

28、的电穿孔方法进行了优化,发现细胞系和电压对转染效率影响显著,同时电压还显著的影响细胞存活率。优化过程中电压以50V 的增幅从100V 提高到350V ,细胞的GFP 阳性率从(3.2±0.8%升高到(43.0±3.4%,而存活率却从(90.5±8.0%降低到(44.8±2.0%。本实验根据以往经验和BTX 代理商推荐的电击参数,分别用6090V/mm 和l10ms 的参数组合转染牛体细胞,并系统的比较了各细胞的转染效率和存活率,实验发现各图4不同转染方法牛三种体细胞的转染效率和存活率同类图例上字母不同(a ,b ,c 或A ,B ,C表示差异显著(P &

29、lt;0.05或极显著(P <0.01Figure 4Transfection efficiency and survival rate of LXH102FFb (A,1001FOV (Band CC (Cunder different transfection methodsValues with different superscripts in the same type of column indicate significant difference or extremely significant difference (a vs b vs c,P <0.05or A

30、 vs B vs C,P <0.01百分比/%P e r c e n t a g eA100806040200核转染Nucleofection (V013电穿孔Electroporation (180V,10ms脂质体Lipofection转染效率Transfection efficiency 存活率Survival rateaab cbc B百分比/%P e r c e n t a g e80核转染Nucleofection (T023脂质体Lipofection1006040200转染效率Transfection efficiency存活率Survival rateAABBC C 电

31、穿孔Electroporation (160V,5msC百分比/%P e r c e n t a g e801006040200转染效率Transfection efficiency存活率Survival rateAABACC 核转染Nucleofection (U023电穿孔Electroporation (180V,10ms脂质体Lipofection1030细胞的转染效率和存活率变化很广,各细胞转染效率随着电压和脉冲时间的升高而增长,最低的是(0.41±0.08%,最高的为(75.03±2.31%;存活率则急剧下降,范围为(90.12±4.47%(23.70

32、±2.47%选择转染效率最高的参数组合为最优参数,LXH102FFb 和CC的最优参数为90V/mm,10ms,1001FOV的为80V/mm,5ms。采用本研究所描述的3种转染方法转染牛体细胞的对比实验目前还未见相关报道,但在其它类型细胞中类似的研究实验已经有很多,Hamm等(2002、Jacobsen等(2006和Maurisse等(2010比较核转染法与脂质体法转染人和其它哺乳动物多种细胞的转染效果,结果核转染法获得最高的转染效率; Nakayama等(2007在猪胎儿成纤维细胞上比较核转染法、电穿孔法和脂质体法的转染效率,各方法优化后分别获得了79.0、53.4和8.2%的最

33、佳转染效率,核转染法的效率明显最高,与本实验结果一致,而且作者将核转染后筛选得到的转基因细胞用于体细胞克隆;在人胚胎干细胞的转染研究中;Cao等(2009在上述3种方法的基础上再加入了病毒转染法进行转染对比实验,虽然核转染法并没有获得最高的转染效率,依然被作者推荐。本实验在LXH102FFb、1001FOV和CC这3种细胞中分别采用核转染程序V013、T023和U023获得了最高的转染效率(98.78±0.30%、(88.43±2.10%和(71.31±0.77%,均显著高于电穿孔法和脂质体法,转染后存活率的比较结果为脂质体法>核转染法>电穿孔法。综合

34、考虑转染效果,我们认为核转染是值得推荐的高效转染方法。总之,核转染法作为一种非病毒的高效转染方法应用于牛体细胞转染是切实可行的,为下一步的稳定转染和筛选转基因细胞打下基础,相信该转染方法终将用于转基因克隆牛的生产并很可能提高转基因克隆的整体效率。3材料与方法3.1化学试剂与实验材料pmaxGFP质粒和核转染试剂为Lonza公司(德国产品;脂质体(Lipofectamine TM2000为Invitrogen 公司(美国产品;胎牛血清(FBS、胰蛋白酶(Trypsin、DMEM和PBS购自Gibco公司(美国;细胞冻存液(cellBanker2购自ZENOAQ公司(日本;其他药品除特殊注明外均购

35、自Sigma公司(美国。细胞培养器皿购自Corning或Nunc公司(美国。Holstein 奶牛胎儿取自山东省农业科学院奶牛研究中心,黄牛胎儿取自山东科龙畜牧产业有限公司的牛场,黄牛卵巢来自北京周边地区屠宰场。3.2牛的各种体细胞系的建立分别取1头3月龄Holstein奶牛胎儿和1头2月龄黄牛胎儿建立奶牛胎儿输卵管上皮细胞系(1001FOV和黄牛胎儿成纤维细胞系(LXH102FFb,组织样被剪碎成1mm3左右的小块,PBS清洗2次后分批植块于含6mL DMEM+20%FBS的25cm2的培养瓶中。以黄牛卵巢组织样建立黄牛卵丘颗粒细胞系(CC,将清理过的卵巢置于培养皿中,用10 mL一次性注射

36、器抽吸卵巢表面26mm大小卵泡中的卵泡液,回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs,PBS清洗2遍后以0.1%透明质酸酶溶液震荡3min,DMEM+10%FBS洗涤离心后重悬至1×105个/mL,6mL细胞溶液铺至25cm2的培养瓶中。牛胎儿组织样和卵丘颗粒细胞于37.5,5%CO2培养箱培养67d,每2d换液1次,待细胞生长汇合后,以0.1%胰蛋白酶消化传代23次,分批冻存,先放置负80度冰箱过夜,再投入液氮长期保存。3.3核转染法转染将冷冻保存的细胞解冻后传代2次,培养至70%80%汇合,0.1%胰蛋白酶消化收集细胞并计数,用核转染液重悬细胞(细胞特异性核转染试剂

37、Basic Nucleofector Solution和Supplement混合得到核转染液,两者体积比为4.51,加入pmaxGFP质粒混匀,把混合液转移到电击杯。按照核转染仪Amaxa R Nucleofector R的操作手册选择与各类细胞对应的推荐转染程序进行转染,完成转染后,向电击杯中加入200L预热的培养液,轻轻吸打,用吸管将细胞混合液转移到含5mL预热培养液的培养皿中放入CO2培养箱培养。48h后参照阴性对照分析转染效率和细胞存活率。每次核转染的细胞数量设为78×105个,核转染液体积为100L,pmaxGFP 质粒2g。3.4电穿孔法转染将冷冻保存的细胞解冻后传代2次

38、,培养至70%80%汇合,0.1%胰蛋白酶消化收集细胞,并进行细胞计数。加入电转缓冲液(PBS中含272mmol/L蔗糖、7mmol/L K2HPO4,1mmol/L MgCl2,pH7.4重悬不同转染方法转染牛体细胞效率的比较Comparison of Different Methods for Transfection Efficiency of Bovine Somatic Cells10311032 Journal of Agricultural Biotechnology 率， 确定与之对应的最佳转染程序。 实验 2： BTX 电穿孔仪(ECM2001设置不同 用 加入 2 mm 电

39、击杯中， 将电击杯放入电击槽， BTX 参数组合对牛的 3 种体细胞进行电穿孔转染实验， 用 电穿孔仪(ECM2001设置相应的参数组合进行电击， 比较各细胞在不同参数组合下的转染效率，找到与 电击后室温静置 2 min， 向电击杯中加入 200 L 预热 之对应的最佳转染参数。 实验 3： 针对牛的 3 种体细胞， 将优化后的核转 的培养液， 轻轻吸打， 将细胞转移到含 5 mL 预热培养 48 液的培养皿中，置 CO2 培养箱培养， h 后参照阴性 染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一 致的情况下进行转染对比实验，比较不同转染方法 对照分析转染效率和细胞存活率。 的转染效率和毒性。

40、 3.5 脂质体法转染 统计学分析：所有实验至少重复 3 次，采用 TM 参照产品 Lipofectamine 2000 使用说明书， 在 SPSS19.0 统计学软 件对数据进 行统计学 分析， 计 调整细胞密度至 5× 量资料所有数据均以平均数(x±标准差(SD表示。 转染前一天, 6 孔板中接种细胞， 105/ 孔。 转染的当天， 细胞密度最好达到 7080， 不同转染方法转染效率的比较采用 ANOVA 检验， 吸出各孔内的培养基， 用无血清 DMEM 培养基漂洗 当 P0.05 时认为差异显著， P0.01 时认为差异 1 次， 向各孔内加入 Opti-MEM 培养

41、基 2 mL。 在新的 极显著。 1.5 mL EP 管中准备溶液 A 和溶液 B， 孔板每孔用 6 量如下， 液： A 250 L Opti-MEM 培 养 基 +2 g 参考文献 B 250 pmaxGFP 质 粒 ， 室 温 下 静 置 5 min， 液 ： L Arat S., Rzucidlo S.J ., G ibbons J., Miyoshi K., and Stice S.L., Opti-MEM 培 养 基 +10 L 脂 质 体 2001, Production of transgenic bovine embryos by transfer LipofectamineT

42、M2000， 室温下静置 5 min。将 A， 两 B of transfected granulosa cells into enucleated oocytes, 种液体混合，室温下静置 20 min 后加入到 6 孔板 Molecular Reproduction and Development, 60(1: 2026 中， 轻轻摇晃使之与细胞均匀接触， 放入 CO2 培养箱 Boggs S., Gregg R.G., Borenstein N. and Smithies O., 1986, Efficient transformation and frequent single-sit

43、e, single-copy 培养。让脂质体 -DNA 复合物与细胞接触 6 h 后， 换 insertion of DNA can be obtained in mouse erythroleukemia 成含有血清的完全培养基继续培养。考虑到转染的 cells transformed by electroporation, Experimental 细胞密度较大， 隔天进行传代， h 后参照阴性对照 48 Hematology, 14(10: 988994 分析转染效率和细胞存活率。 细胞， 每次电转 78×105 个细胞 / 组， 加入 pmaxGFP 质粒 2 g，将细胞悬液

44、及质粒混合均匀后取 200 L Cao F., Xie X.Y, Gollan T., Zhao L., Narsinh K., Lee R.J., and human embryonic stem cells, Molecular Imaging and Biology, 12(1: 1524 Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J., Kane J.J., Jerry J., Blackwell C., Ponce de León F.A., and Robl J.M., 1998, Cloned transgenic calves produ

45、ced from nonquiescent fetal fibroblasts, Science, 280(5367: 12561258 Colosimo A., Goncz K.K., Holmes A.R., Kunzelmann K., Novelli G., Malone R.W., Bennett M.J., and Gruenert D.C., 2000, Transfer and expression of foreign genes in mammalian 农业生物技术学报 3.6 细胞存活率分析 每次转染实验中均设置未转染的阴性细胞为对 照， 而且转染时各组的细胞数量要相同

46、。 转染后培养 48 h， 消化各组细胞准备流式分析时分别进行细胞计 数，然后将各转染组的细胞数量与阴性对照的细胞 数量相除即得出转染后 48 h 的细胞存活率。 3.7 细胞转染效率分析 转染的细胞培养 48 h 后，用 PBS 漂洗 2 遍， 再 Wu J.C., 2009, Comparison of gene-transfer efficiency in cells, Biotechniques, 29(2: 3148, 3202, 324 passim 用 0.1胰蛋白酶消化收集细胞，然后通过流式细胞 Forsberg E.J., Strelchenko N.S., Augenste

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48、er-Genskow M., Voelker G.R., Watt S.R., and Bishop 3.8 实验设计及数据统计 实验 1： 使用推荐程序对牛的 3 种体细胞进行核 转染实验，比较各细胞在不同转染程序下的转染效 M.D., 2002, Production of cloned cattle from in vitro systems, Biology of Reproduction, 67(1: 327333 Fu J., Guan P., Zhao L., Li H., Huang S., Zeng F., and Zeng Y., 2008, Effects of dono

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