一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法

1、3基金项目:中科院知识创新工程,NO.KJCX1-S W -07通讯作者:修瑞娟一种简便高效利用重叠延伸PCR 进行基因定点突变的方法3苏燕1邵国1高嵩单2于明华2修瑞娟2(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室,内蒙古包头014010;2.中国协和医科大学中国医学科学院微循环研究所摘要目的:建立一种简便快速的重叠延伸PCR 基因定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR 的方法将人TGF-2基因启动子区(-270bp +280bp -114bp 的5C GTG3序列定点突变为5TTTG3,前两次PCR 反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需纯化,直接将胶条切下置于EP 管中,-80冷冻10m in

2、,然后将胶条离心后分别取上清液作为模板进行第三次PCR,以获得全长的突变目的基因,最后将此突变基因插入报告载体pG L3-Basic 进行基因测序。结果:人TGF -2基因启动子区突变序列的测序结果与预期完全一致。结论:此方法简便经济、突变准确,是一种非常实用的基因定点突变方法。关键词重叠延伸PCR;基因突变;基因测序A S im ple,Fa st and Eff i c i en t S ite -d i rected M ut agenesisM ethod w ith O ver -exten ti on PCRSU Yan 1,SHAO Guo 1,GAO Songdan 2,Y U

3、 M i n ghua 2,X IU Ru ijuan2(1.D epart m ent of B ioche m istry and M olecular B iology,B aotou M edical College,B aotou 014010,China;2.Institute of M icrocirculation,Peking Union M edical College &Chinese Acade m y of M edical Sciences Abstract Objective:t o intr oduce a si m p le,fast overlap

4、-extensi on PCR site -directed mutagenesis method .Methods:Overlap -extensi on PCR was used t o mutagenate hu man TGF -2gene p r omoter (-270bp +280bp -114bp regi on fr om 5CGTG3t o 5TTTG3.The first t w o PCR p r oducts were electr ophoresised on agar ose -gel,instead of purificati on,the ai m ed se

5、g ments gel were cut down and put int o EP at -80f or 10-20m in cool,then the gel were centrifuged and the supernatants were used as te mp late for the third PCR.The final PCR seg ment was cl oned int o pG L3-basic for sequencing .Results:hua man TGF -2gene p r omoter mutant had been successfully co

6、nstructed .Conclusi on:The method was effective and si m p le for site -directed mutagenesis constructi on .Key words Overlap -extenti on PCR;Mutagenesis;Gene sequencing随着分子生物学研究的突飞猛进,基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段,在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等方面的研究中得到广泛的应用。常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR 介导的定点突变及盒式突变。目前,PCR 介导的定点

7、突变技术是使用最普遍的定点突变方法,以PCR 为基础的突变方法一般有大引物突变、重叠延伸突变及一步快速突变。重叠延伸突变PCR 可以在DNA 区段的任何位置突变,且可以在侧引物的两端设计酶切位点,方便进一步的连接克隆1-2。本研究对传统重叠延伸PCR 法进行定点突变的实验方法进行了改进,进一步节约了实验成本,缩短了实验周期,是一种简便、经济、快速、准确的基因定点突变方法。1材料与方法1.1材料Pyr obest TaqDNA Poly merase 、dNTP 、T4DNA 连接酶、限制性内切酶M lu 和Bgl 及琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司,凝胶回收和质粒提取试剂盒购自北京鼎国生物技术

8、有限责任公司,报告载体pG L3-Basic 购自Pr omega 公司。引物(引物1:5GT ATCAACGCGT AAAACGGG AG ACTTG ATTGT3,引物2:5G AT CT AAG ATCT ATTGCTCGCTT AGGGT AGG3,引物3:5ACCAAAAGCTCT CCCCG AAC3,引物4:5GGG AG AGCTTTTGGT CT AAGT A3由上海生物工程有限责任公司合成,其他试剂均为进口分装。1.2方法9552007年第23卷第6期Vol 123No 162007包头医学院学报J O URNAL O F BAO T O U M E D I CAL COL

9、L EGE子区报告基因的构建首先利用引物1、引物2从人血DNA中扩增人TGF-2基因启动子区-270bp +280bp的基因区段,然后将此PCR产物进行凝胶回收,回收片段与载体pG L3-Basic分别经M lu和Bgl 双酶切后进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5,经克隆培养后挑取阳性菌落进行培养,提取质粒后送公司测序。2结果2.1重叠延伸PCR扩增人TGF-2基因启动子区-114bp区突变基因和分别为5端带有突变位点的短片段PCR产物,是以和为模板进行延伸并扩增得到的带有突变位点的564bpPCR产物,见图1。2.2突变基因的测序质粒测序结果显示,人TGF-2基因启动子区-114位的5C

10、GTG3序列成功突变为5TTTG3,见图2。3讨论经典重叠延伸PCR技术必需在特定的待突变位点和上下游分别设计引物,1、3为上下游引物,2、4为突变引物(且2、4的5端部分互补,先以引物1、3在一定条件下进行PCR,得产物,再以引物2、4进行PCR得产物,将产物和分别纯化回收后,将和混合作为模板,以1、4为引物进行PCR, 即可图1重叠延伸法进行人TGF-2基因启动子区突变M为100bp ladder;为引物1、3扩增产物;为引物2、4扩增产物;为以产物 和为模板,引物1、2扩增得到的突变目的片段图2人TGF-2基因启动子区的基因测序图谱A:人TGF-2基因启动子区-114位的5CGTG3序列

11、;B:突变型人TGF-2基因启动子区-114位的5TTTG3序列得到带突变位点的DNA片段。将其装入特定的载体中,转化入相应的宿主菌,扩增后经鉴定得到了带有突变位点的目的DNA3-4。本实验对经典的重叠延伸PCR技术进行了改进,采用琼脂糖凝胶条冻融的方法取代了对产物和的纯化回收,用含有目的片段的凝胶条冻出液作为第三次PCR的模板进行突变片段的扩增,不仅节约了实验成本,缩短了实验周期,而且取得了很好的实验效果,是一种非常简便、快速、实用的实验方法。参考文献1U rban A,Neukirchen S,Jaeger KE.A rap id and efficientmethod f or site-directed mutagenesis using one-step over2lap extensi on PCRJ.Nucleic Acids Res,1997,25(11:2227-2228.2孙梦宁,薛小平,尹文,等.运用重叠PCR技术构建HCV全长c DNA细胞培养适应性突变体J.生物技术通讯,2006,17(1:27-30.3Ho S N,Hunt HD,Hort on R M,et al.Site-direc