不同极性石斛生物碱的提取分离及对人晶状体上皮细胞增殖的影响

1、不同极性石斛生物碱的提取分离及对人晶状体上皮细胞增殖的影响    【摘要】  【目的】观察不同极性石斛生物碱对人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用。【方法】石斛粉末经乙醇提取、降膜浓缩、酸化、盐析、萃取后，水洗、回收提取分离不同极性生物碱。HLEC用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液培养，石斛生物碱的保护作用实验分为10组：正常对照组，模型组，水溶性生物碱、脂溶性生物碱、低极性生物碱、弱极性生物碱高、低剂量组，剂量均分别为250、125g/L;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同极性生物碱对HLEC增殖的影响。【结果】通过单因素实验，

2、获得了影响不同极性石斛生物碱提取率的关键因素，均为体积分数80%乙醇提取3次，提取3h时提取率最高;模型组HLEC增殖被H2O2明显抑制，低剂量脂溶性生物碱组细胞抑制率显著降低，与模型组比较差异有显著性意义(P<005)。【结论】较低剂量的脂溶性生物碱能更好地抑制H2O2对晶状体上皮细胞的氧化损伤。 【关键词】  石斛/分离与提纯;石斛/药理学;晶状体上皮细胞/病理学;细胞培养石斛为兰科石斛属附生草本植物，神农本草经将其列为中药上品。本草纲目记载：金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”。生物碱是石斛重要的有效化学成分之一1-4。研究表明金钗石斛总生物

3、碱具有抗肿瘤、抑制心血管和胃肠道的作用且能止痛退热5-6。前期研究表明石斛生物碱具有良好的抗白内障作用7-9。但生物碱的成分复杂5，为进一步确定其有效成分，本研究提取分离了不同极性的生物碱并比较其对人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用。对石斛生物碱提取工艺的各个关键步骤进行了探索，得到了较好的工艺条件，收率和含量都有了较大的提高。现报道如下。1材料与方法11细胞株人晶状体上皮细胞株SRA01/04(HLEC)由中山大学眼科中心提供。12药材、试剂及仪器金钗石斛(贵州赤水信天石斛有限公司，广州中医药大学中药学院李薇教授鉴定)，新生小牛血清及DMEM培养基(Gibco公司)，二甲基甲砜(DMSO

4、，广州市康洋化工有限公司)，M193863MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(北京中西远大科技有限公司)，胰蛋白酶(美国Difco公司，上海生工生物工程公司代理)，薄层层析硅胶GF245(上海江莱实验设备有限公司)，其他试剂均为分析纯。PM6型倒置显微镜(日本Olympus公司)，ELx800型酶标仪(美国Bio Tek公司)，E52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHZD()型循环水式真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂)，BP221S型电子分析天平(上海精密仪器表有限公司)。13不同极性生物碱的提取分离131醇提与浓缩将无杂质的金钗石斛茎用清水洗净，然后烘干、粉碎，使其长约05cm;将

5、打好粉的石斛放入10L的圆底烧瓶内，加入8倍体积的80%(体积分数，下同)乙醇，上接冷凝管，水浴锅保持在85，回流提取3次，每次3h;合并提取液进行降膜浓缩，浓缩至小体积后，用旋转蒸发仪在65时继续浓缩至无醇味，得到浓缩水液。132酸化与盐析取1/3浓缩水液，用旋转蒸发仪在90时继续浓缩，将剩余的水分蒸干，得到黑色浸膏，将配好的体积分数5%盐酸溶液溶解浸膏进行酸化，边加边搅拌直至浸膏全部溶解，过滤酸水液。加入NaCl晶体，边加边观察，直至饱和，此时有黑色黏稠状物质析出，过滤保存黑色黏稠状物质。133氯仿萃取、水洗与回收过滤后的酸水液用氯仿萃取，萃取比例为31即酸水液氯仿(31，体积比，下同)，

6、萃取10次。合并氯仿层，在旋转蒸发仪上回收氯仿至小体积。将回收至小体积的氯仿层用纯净水洗至中性，水洗比例即氯仿水(31)，水洗20次。合并水洗后的氯仿层，用旋转蒸发仪在50时回收氯仿，可得脂溶性生物碱。取2/3浓缩水液，用氯仿萃取，萃取比例为31即酸水液氯仿(31)萃取10次。合并氯仿层，在旋转蒸发仪上回收氯仿至浸膏，得弱极性生物碱。134碱化将酸化并用氯仿萃取后的酸水层用浓氨水调节pH在910之间进行碱化。氯仿萃取碱水层，萃取比例为31，即碱水层氯仿为31，萃取10次。合并氯仿层，在旋转蒸发仪上回收氯仿至小体积。水洗至中性，即得低极性生物碱。135正丁醇萃取、水洗与回收将碱化并用氯仿萃取后的

7、碱水液用正丁醇萃取，萃取比例为31，即碱水液正丁醇为31，萃取10次，合并正丁醇层，在旋转蒸发仪上回收正丁醇至小体积。用纯净水萃取正丁醇，萃取比例31，即正丁醇水为31，合并被正丁醇萃取后的水溶液(正丁醇饱和水)。用正丁醇饱和水萃取正丁醇层，萃取比例为31，即正丁醇层正丁醇饱和水为31，萃取10次。用旋转蒸发仪在65时回收正丁醇，即得水溶性生物碱。136不同极性生物碱的检识分别将上述各极性生物碱浓缩至浸膏状，取不同极性生物碱浸膏各1mg,分别用1mL的水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚溶解。结果表明4种物质均溶于乙醇和乙酸乙酯，其中极性最大者易溶于水，弱极性生物碱和脂溶性生物碱易溶于石油醚，低极性生物

8、碱溶于乙醇和乙酸乙酯。生物碱提取率的计算公式为：p提取(%)=m生物碱/m干粗分×100%。14不同极性生物碱对HLEC增殖的影响141培养试剂的配制用乙醇配制一定浓度的各极性生物碱储存液，使用时稀释至所需浓度，使乙醇终浓度不高于01%(体积分数，下同)，此浓度对细胞无影响。体积分数30% H2O2用无菌去离子水稀释至所需浓度。142HLEC的培养HLEC用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37、体积分数5%CO2培养箱内培养，细胞形态呈多角形或不规则形，34d可融合。融合成片的细胞，中央部分细胞呈六边形，大小较一致。细胞生长接近融合时及时传代或冻存，按13或14分瓶传代

9、。143分组与给药实验分为10组，即正常对照组：正常HLEC+DMEM;模型组：正常对照组+500mol/LH2O2;水溶性生物碱高剂量组：模型组+250g/L水溶性生物碱;水溶性生物碱低剂量组：模型组+125g/L水溶性生物碱;脂溶性生物碱高剂量组：模型组+250g/L脂溶性生物碱;脂溶性生物碱低剂量组：模型组+125g/L脂溶性生物碱;低极性生物碱高剂量组：模型组+250g/L低极性生物碱;低极性生物碱低剂量组：模型组+125g/L低极性生物碱;弱极性生物碱高剂量组：模型组+250g/L弱极性生物碱;弱极性生物碱低剂量组：模型组+125g/L弱极性生物碱。144四甲基偶氮唑盐(MTT)法检

10、测不同极性生物碱对HLEC存活率的影响消化并收集生长良好、呈对数生长期的HLEC,以含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液。接种于96孔板培养板中，每孔200L，细胞浓度为8×103个/mL,置于37、体积分数5%CO2培养箱中培养24h后，弃去培养液，加入无血清的DMEM液，继续培养24h，使细胞同步化，24h后按143项下方法分组与给药。继续培养24h后，弃去培养液，在各组培养板分别加入200LMTT试剂(终浓度为05mg/mL)。继续培养4h，吸去MTT溶液，加入150LDMSO溶液，轻轻振荡10min后，于全自动酶标仪上490nm波长处测各组的吸光度(D)值，计算抑制率：p抑制(%)=(D正常对照组-D药物组)/ D正常对照组×100%。15统计学方法应用SPSS130统计软件进行数据分析，数值变量两组间采用t检验或t检验，多组间两两比较采用F检验，检验水平=005。2结果21不同极性石斛生物碱提取分离的单因素分析生物碱不溶或难溶于水而溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，因此，选用乙醇溶液作为提取溶剂。211乙醇浓度的影响由图1可见金钗石