不同剂量芽孢杆菌对功毒后鲤鱼生长和肉质的改善作用

1、枯草芽孢杆菌对荧光假单胞菌感染鲤生长和肉质的作用摘要：本实验研究了枯草芽孢杆菌对荧光假单胞菌感染鲤的生长和肉质的影响，初步确定枯草芽孢杆菌的最适添加剂量。将630尾健康鲤鱼分成7组，其中5组用荧光假单胞菌攻毒感染后，饲喂添加不同浓度芽孢杆菌的日粮，剩余2组为对照，以基础饲料分别饲喂健康鲤和感染鲤，28 d后采样检测鲤鱼的生长性能和肉质。结果显示：感染后鲤鱼的生长性能和肉质指标都有下降，生长性能随着添加浓度的提高表现出先上升后下降的趋势，其中添加0.5-1×107 cfu /g组的添加效果最好，粗蛋白和生长性能与正常组无显著的差异（P > 0.05)，表明芽孢杆菌在合适的添加浓度

2、下可以改善功毒后鲤鱼的生长性能和肉质指标。关键词：鲤鱼 生长性能 肉质 芽孢杆菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluoroscens)是淡水鱼类赤皮病的主要病原菌，为革兰氏阴性菌 宋桂玲.春季鱼类赤皮病的防治要点J.黑龙江水产,2009,(3):21-22.。草鱼、青鱼、鲤鱼、鲫鱼等大多数淡水鱼类均可患此病 严必福.水霉病和赤皮病的病理及其防治技术的改进J.中国水产,2005,(1):49-50.，该病发病范围广，在我国各养殖水域均有流行。给我国淡水养殖业造成了严重的损失。目前，对该病的防治主要用抗生素和化学药剂，效果不甚明显，长期使用造成大量的耐药菌株产生，于此同时鱼肉中药物残留也会

3、危及消费者健康。芽孢杆菌(Bacillus)为一类常用的益生菌，具有抑制有害菌 沈智华,沈锦玉,尹文林,等.枯草芽孢杆菌B115优化培养及其对气单胞菌的抗菌效果的研究J.微生物学通报.2005,32(4).79-84.、改善水质 杭小英,叶雪平,施伟达,等.枯草芽孢杆菌制剂对罗氏沼虾养殖池塘水质的影响J.浙江海洋学院学报(自然科学版), 2008,27 (2):197-200.、促进动物生长 付天玺,许国焕,吴月嫦,等.凝结芽孢杆菌对奥尼罗非鱼消化酶活性、消化率及生长性能的影响J.淡水渔业.2008,38(4):30-34.及提高免疫 Nayak S.K,Swain P, Mukherjee

4、S.C.Effect of dietary supplementation of probiotic and vitamin C on the immune response of Indian major carp,Labeo rohita (Ham.) J.Fish & Shellfish Immunology, 2007,23:892-896等诸多功能。芽孢杆菌对水生动物肉质的影响研究较少，陆生动物上，陈凤芹 陈凤芹,张伟力,骆先虎.益生素对皖南黄鸡肉质性能影响的研究J.中国畜禽种业,2007,(03):33-36.等在皖南黄鸡日粮中添加芽孢杆菌，发现肌肉肉样系水力增加，肉质得到

5、显著改善。当前芽孢杆菌研究主要集中在健康动物，而对感染后芽孢杆菌对水生动物生长和肉质影响的研究还未见报到。本实验采用芽孢杆菌制剂添加到日粮中投喂感染鲤，测定供试鲤的生长性能指标和肌肉营养成分，以探讨枯草芽孢杆菌对感染后鲤的生长性能和肉质的影响，从而为芽孢杆菌在水产养殖业中合理使用提供一定的理论和实验依据。1、材料与方法1.1 试验材料攻毒菌制备 荧光假单胞菌菌株由武汉水生生物研究所提供。将荧光假单胞菌接种在液体肉汤培养基中，37 下培养 48 h，离心集菌，用灭菌生理盐水清洗 3 次，并用生理盐水将其浓度调整至 1.5×107 cells/ml，用作鲤攻毒感染。 益生菌 枯草芽孢杆菌

6、 由四川农业大学微生态研究中心，活菌数达2×109 CFU/g。 试剂与器材 微量凯氏定氮仪全套，索氏抽提器全套，马福炉，天平，刻度尺。1.2 试验鱼及饲养条件实验鲤购自邛崃渔场，体态正常，健康无病，每尾鲤鱼平均体重为(12±2)g。购后置于大水泥池中暂养。饲养前用具和水池用强氯精进行消毒。试验用水使用自然河水，流水饲养。PXC-35精密离子计和水质分析盒监测水质，pH 6.8-7.5，溶氧 8-10 mg/L,水温20-24 ；硫化物、非离子氨、重金属Hg、Cd、Cu、Pb、As符合渔业水质标准(GB11607-89)。1.3 日粮配制蛋白质、复合维生素和复合矿物质等需要

7、量参照鲤鱼、大西洋鲑或虹鳟的营养需要，基础日粮配方见表 1。试验日粮是在基础日粮基础上添加不同浓度的芽孢杆菌制剂见表 2。表1基础日粮配方Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DMbasis,%)饲料原料 Ingredients含量Content营养水平Nutrient levels含量Contet豆粕 Soybean meal33.5粗蛋白 CP35.08鱼粉 Fish meal10赖氨酸 Try1.85菜籽饼 (cp36%)20蛋氨酸 Met1.13次粉wheat middling and red dog18有效

8、P0.87麦麸wheat bran3.3总Ca0.97棉粕cottonseed meal (sol.)10粗纤维 CF5.70磷酸二氢钙Ca(H2PO4)21.8粗脂肪 EE4.18维生素预混料Vitamin premix 0.2a. 每千克维生素预混料含:VA（500000IU/g）0.8000g，VD3（500000IU/g）0.4800g，DLa生育酚醋酸酯（50%）20.0000g，VK3（23%）0.2200g，VB12（1%）0.1000g，D-生物素（2%）5.0000g，叶酸（96%）0.5210g，盐酸硫胺素（90%）0.1133g，VC磷酸酯（93%）7.1613g，烟酸（

9、99%）4.1646g，肌醇（99%）52.3232g，泛酸（90%）2.5578g，核黄素（80%）0.6250g，VB6（81%）0.7494g，次粉905.1844g；b. 每千克微量元素预混料含量：CuSO4.5H20（25.00%Cu）1.2005g， MnSO4.H2O（31.8%Mn）4.0885g，KI（3.8%I）2.8950g，NaSeO3（1%Se）2.5000，ZnSO4.7H2O（34.5%Zn）14.1130g，FeSO4.7H2O（30%Fe）45.7667g，次粉929.4363g。矿物质预混料Mineral premix0.5鱼油 Fish oil 1.2豆油

10、soybean oil1.2氯化胆碱(50%) choline chloride0.3总计 grand total 100表2 实验分组Table2 The random groups and treatment处理组1234567重复数3333333鱼尾数/重复30303030303030攻毒处理-+日粮中芽孢杆菌含量000.050.250.50.751.01.4 饲养管理试验鲤在大池中暂养，以基础日粮投喂，2 周后开始正式试验。将暂养后的鲤随机分成 7 组，感染处理后分别饲喂基础日粮和试验日粮，每组设 3 个重复，每个重复30 尾，组间无显著性差异（P0.05），试验持续28 d。每天分别

11、在09:00-10:00、16:30-17:00 投喂1次，每天按试验鱼体重4 %-5 %投喂饲料。1.5 攻毒感染在实验开始时，对照组腹腔注射0.1ml的无菌生理盐水；感染组腹腔接种上述(含菌量 1.5×107 cells/ml)细菌培养液 0.1ml ，分别放回水池中，保持各方面条件相同，观察鱼的变化。1.6 样品采集在实验开始后 28 d 采样，每次每箱随机取鲤 5 尾。采样时鲤鱼停食24 h，测体长，体重，用于生长性能的测定；从尾动脉采血进行血液分析，用 0.1 %的肝素钠抗凝的血液进行生理指标的测定；吸干鱼体表的水分后，于鱼体鳃盖后缘至背鳍第一鳍条处的侧线以上部位取白肌，去

12、皮。-20 下冷藏备用，用于营养成分的测定。 1.7 测定指标与方法 生长性能计算丰满度，绝对生长率，相对生长率，瞬时增长率和生长比速。丰满度，k=100×W/L3；绝对生长率，g=(W2-W1)/(t2-t1)；瞬时生长率，g=(W2-W1)/W1×(t2-t1)；上述公式中，W1为试验开始时体质量(g)，W2为试验结束时体质量(g)，L1为试验开始时体长(cm)，L2为试验结束时体(cm)，t1为试验开始时间(d)，t2为试验结束时间(d)。 肌肉基本成分测定水分、粗蛋白、粗脂肪与粗灰分。其中水分含量测定采用105 烘干失水法 杨太有,王琳,李仲辉,等.池养黄河鲤鱼含肉

13、率及其肌肉营养成分的分析J.海洋湖沼通报,1996 (4):55-58, 陆茂英,包晓英.建鲤等几种鱼类生化组成的分析J.建鲤育种研究论文集.北京:科学出版社,1994,85-88. ；粗蛋白质测定采用微量凯氏定氮法；粗脂肪测定采用索氏抽提法；粗灰分测定采用马福炉灼烧法(550) 6,7。 肉质指标失水率的测定 任泽林,李爱杰.饲料组成对中国对虾肌肉组织中胶原蛋白、肌原纤维和失水率的影响J.中国水产科学,1980,5(02):40-44. ：取鱼体背部肌肉5g，称重(W0)，于沸水中煮5 min，捞出冷却，用吸水纸吸去表面水分，称重为W1，计算：失水率 =W0W1W1 × 100。

14、血液指标测定红细胞计数( RBC)：用红细胞稀释液(0. 089 %的氯化钠溶液)，将血液稀释200倍，用血细胞计数板在显微镜下计数。白细胞计数(WBC)：用醋酸龙胆紫稀释液(2 %冰醋酸 + 1 %龙胆紫)将血液稀释 20 倍，用血细胞计数板在显微镜下计数。溶菌酶活力：比浊法测定，具体参照试剂盒说明书。（购自南京建成生物）补体C3/C4：比浊法测定，具体参照试剂盒说明书。（购自伊利康生物技术有限公司）1.8 统计分析 数据以平均值±标准误表示，试验结果用SPSS 13.0软件进行显著性t检验。2 结果与分析2.1 感染后鲤发病情况试验鱼感染 4d后，表现为：精神萎顿，很少游动。陆续

15、出现死亡，死亡鱼统一表现：体表充血，出血，鳃苍白腹部膨大，肛门红肿突出。在接种部位有一块圆形病灶，该处鳞片向外张开，松动易脱落，鳞下体表充血，出血肿胀。腹腔内有红色的腹水，各组织器官均有不同程度的病变，肠壁充血发炎，肝脏肿大，肾也肿大发生病变。2.2 生长性能表3 鲤鱼生长性能指标Table3 Growing performance of Carp项目1234567丰满度%2.71 ±0.21ab2.56±0.16b2.65±0.16ab2.63±0.22ab2.77±0.27a2.75±0.23a2.63±0.21ab绝对

16、生长率%0.27±0.02aA0.22±0.01bB0.23±0.03abAB0.26±0.03aAB0.25±0.02aAB0.24±0.02abAB0.24±0.03abAB瞬时增长率%0.0014±0.00010 aA0.0012±0.00003 bB0.0013±0.00014 abAB0.0014±0.00014 aAB0.0014±0.00008 aAB0.0013±0.00010 abAB0.0013±0.00012 abAB存活率%100.

17、00±0.00 a92.22±1.92b93.34±5.77b94.44±1.93b93.33±0.00b93.33±3.34b93.33±3.34b注：同行相同字母表示无显著差异，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)。从表3可以看出与正常组相比感染后鲤鱼的生长性能都有所下降，在日粮中添加枯草芽孢杆菌后感染鲤的生长性能有所提高，并呈现出对添加剂量的相关性，2组感染后没有饲喂芽孢杆菌鲤的丰满度、绝对生长率、瞬时增长率都是同期最小值，4组生长性能在感染组中同期最

18、好。丰满度2组最低与其5、6组相比显著降低(P < 0.05)，其余各组间的差异不显著，5组丰满度数值为同期最大。2组的绝对生长率、瞬时增长率与3、6、7组无显著差异，但与4、5组相比显著降低(P < 0.05)，与1组相比极显著的降低(P < 0.01)。鲤感染荧光假单胞菌以后存活率显著下降(P < 0.05)，饲喂枯草芽孢杆菌对感染鲤存活率无明显影响。2.3 肌肉基本成分指标表4 肌肉基本营养成分指标Table 4 Muscle nutrional composition of Carp项目1234567粗蛋白%17.56±0.36aA16.02±

19、;0.26cB16.95±1.14abcAB17.53±0.44aA17.29±0.40abAB16.45±0.36bcAB16.48±0.47abcAB粗脂肪%2.31±0.02c2.54±0.04a2.51±0.03ab2.35±0.10bc2.40±0.09abc2.42±0.07abc2.53±0.03a水分%77.96±0.64b79.17±0.72a78.02±0.37b77.90±0.44b78.26±0.47a

20、b78.60±0.30ab78.76±0.29ab粗灰分%1.83±0.031.85±0.041.88±0.011.81±0.061.85±0.041.92±0.021.88±0.03注：同列相同字母表示无显著差异，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)。表 4表明，与正常组比较感染鲤（2组）肌肉中粗蛋白含量极显著降低(P < 0.01)。在感染鲤日粮中添加不同剂量枯草芽孢杆菌后，3、4、5、6、7组鲤肌肉中粗蛋白含量均高于未添加组，

21、除6组外均与正常组无显著差异，其中5组粗蛋白含量显著高于未饲喂组（2组）(P < 0.05)，4组极显著的高于2组(P < 0.01)，6组粗蛋白含量显著低于1、4组(P < 0.05)，其余各组间无显著差异。粗脂肪含量2、7组显著高于1、4组(P < 0.05)，3组粗脂肪含量显著高于1组(P < 0.05)，其余各组之间无显著差异。2组水分含量最高且显著高于1、3、4组，其余各组间差异不显著。此外各组鲤肌肉粗灰分含量接近没有显著差异。2.4 血液指标血液红白细胞数，溶菌酶，补体C3、C4。表5枯草芽孢杆菌对感染鲤血液生理指标的影响项目1234567红细胞数(1

22、06/ ml)20.00±1.0018.97±0.8119.03±1.3319.63±1.3919.57±1.7919.00±0.7218.93±0.74白细胞数(万/ ml)56.50±1.71bB59.03±1.77abAB60.30±1.70aAB61.00±1.00aA60.73±1.48aAB59.33±1.76abAB59.03±1.70abAB溶菌酶活(g/ml)17.61±0.53 dC18.80±0.33 bcdBC2

23、0.51±1.26 aAB20.89±0.30 aA20.22±0.76 abAB19.50±0.49 abcABC18.08±1.13 cdC补体C3活力mg/L25.74±2.57b 21.68 ±1.17d 22.81 ±2.08c 28.23 ±2.82a 28.00 ±1.80a26.19 ±2.62b 23.94 ±1.39c 补体C4活力mg/L77.67±4.53bc65.56±7.75d69.11±5.65d78.78±

24、;6.30b84.33±7.78a76.89±6.74c61.11±3.90d注：同列相同字母表示无显著差异，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)。 从表5中我们看到，在感染荧光假单胞菌后鲤血液中红细胞含量显著下降，而饲喂芽孢杆菌后对红细胞数量有一定的提升，感染组中4、5组的血液红细胞数量最高，各组之间并无统计学差异。感染后鲤白细胞数量增加，饲喂芽孢杆菌组白细胞的数量增加更快，3、4、5组显著高于1组(P < 0.05)，与正常组比较4组白细胞数量极显著上升(P < 0.01) ，其余

25、各组之间差异不显著(P > 0.05)。血清溶菌酶活：4组极显著高于1、2、7组(P < 0.01)，3、5组极显著高于1、7组(P < 0.01)，3组显著高于2组，5组显著高于1、7组，6组显著高于1组，其余各组之间差异不显著(P > 0.05)。血清补体C3活力：4、5组显著高于其余各组(P < 0.05)，1、6组显著高于2、3、7组(P < 0.05)，3、7组显著高于2组(P < 0.05)，其余各组之间差异不显著(P > 0.05)。血清补体C4活力：5组显著高于其余各组(P < 0.05)，4组显著高于2、3、6、7组(P

26、< 0.05)，1、6组显著高于2、3、7组(P < 0.05)，其余各组之间差异不显著(P > 0.05)。3 讨论3.1芽孢杆菌对感染鲤生长的促进作用本实验结果表明在荧光假单胞菌感染鲤鱼后，造成鲤发病死亡，鲤鱼的生长性能显著降低，而添加适量的枯草芽孢杆菌以后感染鲤的生长性能得到显著提高。2组感染后没有饲喂枯草芽孢杆菌，鲤的丰满度与正常鲤鱼相比都显著降低(P < 0.05)，绝对生长率、相对生长率比正常鲤下降达到极显著(P < 0.01)。说明荧光假单胞菌感染鲤以后会造成鲤应激和组织器官损伤使生长性能显著降低。而枯草芽孢杆菌能产生较强的蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、纤

27、维素酶等 Ghosh K,Sen S K,RayA K,etal.Characterization of B acillus isolated from the gut of rohu,Labeo rohita, fingerlings and its significancein digestion J. Journal of Applied Aquaculture, 2002,12 (3):33-42.。这些酶进入宿主肠道的“酶池”，提高了宿主的消化酶活性，补充了内源酶的不足，也能使动物小肠黏皱襞增多，绒毛长度增长，增强肠黏膜上皮细胞吸收功能 余成瑶,郑黎,周毅,等.肉鸡饲喂益生素后小肠粘

28、膜上皮细胞、肝细胞超微结构功能研究 J.四川农业大学学报.1996,14(1):61-66.；同时还能拮抗病原菌，维持和调节鱼体肠道菌群平衡 王红宁,胡延秀,何明清,等.微生物添加剂饲喂鲤鱼肠道菌群的变化研究J.四川农业大学学报.1994,12 (增刊):654-657.，减少降解胆酸的细菌数量，提高脂溶性营养物质的吸收，从而从消化吸收两方面促进动物生长。在感染鲤饲料中添加枯草芽孢杆菌3、4、5、6、7组的生长性能都有提高，并随着添加剂量的增大，4、5组生长性能达到最高。而在添加了过量的枯草芽孢杆菌以后对感染鲤的生长性能改善作用逐渐减弱，6、7组在添加了过量枯草芽孢杆菌以后生长性能比4、5组下

29、降但也好于同期的2组。这可能是由于过量的枯草芽孢杆菌在肠道中产生了大量外源酶，从而抑制了机体内源酶分泌，使肠道中酶量减少。同时过多的芽孢杆菌对动物肠道造成了过度刺激，使动物体产生应激，芽孢杆菌在生长繁殖的时候还会消耗大量的营养物质，使日粮的营养水平下降，降低生产性能。在虹鳟 鲁琳,于志强,燕楠.资源化微生物添加剂对虹鳟生长性能的影响J.饲料研究.2007,(3):3-5.、黄尾笛鲷 华雪铭,周洪琪,邱小琮,等.饲料中添加芽孢杆菌和硒酵母对异育银鲫的生长及抗病力的影响J.水产学报.2001,25(05):448-453.、重口裂腹鱼 何敏,汪开毓,张宇,等.复合微生物制剂对重口裂腹鱼生长、消化酶

30、活性、肠道菌群及水质指标的影响J.动物营养学报.2008,20(05):534-539.、鲤 潘康成,何明清,刘克琳.微生物添加剂对鲤鱼生长和消化酶活性的影响研究J.饲料工业.1997,18(10):41-42 .等实验表明，饲料中添加微生物制剂可使鱼末均重和增重率均显著提高。本实验中结果也显示，感染后未饲喂芽孢杆菌鲤的生长性能显著的下降，而饲喂了芽孢杆菌的各组生长性能得到改善与正常组比较无显著的差异，说明在日粮中添加芽孢杆菌能提高饲喂动物的生长性能。但是芽孢杆菌对动物促长的效用报道并不一致，在异育银鲫、凡纳滨对虾、奥尼罗非鱼上的最适添加剂量分别为4×106、2×107、1

31、×108 CFU/g，江萍等 江萍,夏先林,周碧君.两种微生态调节剂对网箱鲤鱼生产效果的影响J.中国微生态学杂志,1997,9(3):26-28.实验，将芽孢杆菌制剂添加于鲤饵料中，发现鲤增重率下降，而且饵料利用率也下降，显示出鲤对该芽孢杆菌株的不适应性。由此可见，芽孢杆菌在水产动物饲料的添加效果可能因鱼的种类、饲料蛋白含量、芽孢杆菌菌种和饲料加工工艺等因素而异。因此在养殖业上应用优良菌种添加合适的比例不仅可以促进感染鲤的生长性能还能降低饲料成本。本试验条件下，枯草芽孢杆菌最适添加量为0.5-1×107 CFU/g。3.2 芽孢杆菌对感染鲤肉质及营养成分的影响肌肉营养成分是

32、衡量养殖产品肌肉品质的重要指标 林利民,王秋荣,王志勇,等.不同家系大黄鱼肌肉营养成分的比较J.中国水产科学,2006,13 (2):286-291.。在一定的生长发育阶段，鱼类肌肉的营养成分是相对恒定的，但肌肉主要营养成分既受遗传因子的影响，又受环境因子的控制。随着外界环境(饲料营养成分、食物组成、养殖水环境、养殖技术管理、加工技术等)的改变，鱼类肌肉主要营养成分也会发生相应的变化 吴莉芳,秦贵信,张东鸣,等.饲料大豆蛋白对鲤鱼生长及肌肉营养成分的影响J.西北农林科技大学学报(自然科学版).2008,36(10): 67-73.。鱼类白肌的营养成分比较稳定，因此，本实验分析白肌的营养成分 沈

33、晓芝,周洪琪,华雪铭,等.羟基蛋氨酸钙对鲤生长性能和白肌营养组成的影响J.上海水产大学学报,2007,16(2):118-123.。在陆生动物上的研究表明，在日粮中添加微生物制剂能提高松辽黑猪 商小峰,李娜,张树敏,等.不同添加剂对松辽黑猪生长性能、胴体品质和肉质的影响J.吉林农业大学学报,2008,30(1):79-83.、皖南黄鸡 陈凤芹,张伟力,骆先虎.益生素对皖南黄鸡肉质性能影响的研究J.中国畜禽种业,2007,3(3):33-36.肌肉品质。本实验表明荧光假单胞菌感染后鲤的肉质会发生变化，与正常组比较肌肉中水分、脂肪含量上升而蛋白含量下降，2组粗蛋白含量极显著降低(P < 0.

34、01)，水分含量、粗脂肪含量都显著上升(P < 0.05)。饲喂芽孢杆菌各组的肉质有了一定的改善，随着芽孢杆菌添加剂量的升高，鲤摄入的营养成分增多，鱼体蛋白的合成率和沉积率增大。3、4组肌肉水分比未添加芽孢杆菌的2组显著降低(P < 0.05)，一般来讲，鱼肉水分含量高，则粗蛋白、粗脂肪含量将会减少，鱼肉品质就差，反之，鱼肉水分含量低，则粗蛋白、粗脂肪含量就高，鱼就肥嫩好吃、鱼肉品质就好 黄永春,王盛伦,郑江,等.有效微生物制剂(EM)对建鲤肌肉生化指标影响的初步研究J.福建水产,1998, (1) :38-41.。4组肌肉粗蛋白含量极显著的高于2组(P < 0.01)，并和正常组（1组）无显著差异(P > 0.05)，5组肌肉粗蛋白含量也显著的高于2组(P < 0.05)。这与华雪铭在暗纹东方鲀幼鱼上实验结果一致 华雪铭,周洪琪,张宇峰,等.饲料中添加壳聚糖和益生菌对暗纹东方鲀幼鱼生长及部分消化酶活性的影响J.水生生物学报,2005,29(03):299-304.。在过量的添加芽孢杆菌后饲料中的营养成分降低，鱼类应激增大，使鱼类肉质下降，粗蛋白含量逐渐下降，6组肌肉粗蛋白含量显著低于4组(P < 0.05)。蛋