不同微环境对骨髓间充质干细胞分化为产胰岛素细胞影响

1、第四军医大学硕士学位论文目录缩略语表 . 1中文摘要 . 2ABSTRACT . 5前言 . 9文献回顾 .11第一部分 干细胞治疗糖尿病研究进展 . 11第二部分 骨髓间充质干细胞与微环境的研究进展 . 28正小文 . 46第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学特性 . 461 材料. 462 方法. 483 结果. 514、讨论. 54第二部分 不同微环境对骨髓间充质干细胞分化为产胰岛素细胞的影响 . 571、材料. 572、实验方法. 593、结果与分析. 624、讨论. 64第三部分 骨髓间充质干细胞在糖尿病大鼠体内微环境下分化的研究 . 671、材 料. 672、实验方法.

2、 683、结果与分析. 714、讨论. 74结 . 78参考文献 . 79附图 . 100个人简历和研究成果 . 103致谢 . 104第四军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词MSCsIPCsESCsASCsPSCsIDDMNIDDMFCSITSKGFDMSOSTZSPBSADMEMDABPBSrpmDTZPDX-1CK英文全称mesenchymal stem cellsinsulin-producing cellsembryonic stem cellsadult stem cellspancreas stem cellsInsulin dependent diabetes mellitusN

3、on-insulin dependent diabetes mellitusFetal calf serumInsulin-Transferrin-Seleniumkeratinocyte growth factordimethyl sulfoxideStreptozotocinStreptavidin peroxidasebovine serum albumindulbeccos modified eagle mediumdiaminoben zidinphosphate buffered salinerevolutions per miniutedithizonepancreas duod

4、enum homeobox-1Cytokeratin-1-中文全称间充质干细胞产胰岛素细胞胚胎干细胞成体干细胞胰腺干细胞胰岛素依赖性（型）糖尿病非胰岛素依赖型（型）糖尿病胎牛血清胰岛素铁硒传递蛋白角朊细胞生长因子二甲基亚砜链脲菌素辣根酶标记链酶卵白素牛血清白蛋白DMEM 培养液二氨基联苯胺磷酸盐缓冲液每分钟转速双硫腙胰十二指肠同源因子-1细胞角蛋白第四军医大学硕士学位论文不同微环境对骨髓间充质干细胞分化为产胰岛素细胞的影响硕 士 研 究 生：黄盛导师：窦科峰 教授宋振顺 教授第四军医大学西京医院肝胆外科，西安 710032中文摘要糖尿病是常见的慢性疾病，全世界患病率约 6。患者常需要终身注射胰

5、岛素治疗，但胰岛素注射疗法对血糖的控制并不理想,无法阻止糖尿病肾病、冠心病、糖尿病眼病等并发症的发生和发展。最近几年胰岛移植的成功表明了通过补充缺乏的细胞可以治愈糖尿病。但供体来源缺乏和移植排斥阻碍了胰岛细胞移植的广泛应用。干细胞作为一类具有极强自我更新及多向分化潜能的细胞，已经逐渐成为人们寻找胰岛细胞替代物的新的细胞资源。由于骨髓间充质干细胞（MSCs）具有多向分化和很强的增殖能力，具有用于细胞治疗的巨大潜能。它们可以分化为神经细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、软骨细胞和产胰岛素细胞等。但是由骨髓间充质干细胞诱导分化而来的产胰岛素细胞（IPCs），其胰岛素分泌量不足正常胰腺细

6、胞的1。如何促进MSCs分化为较成熟的IPCs成为亟待解决的关键问题。目前认为其分化机制，主要是微环境因素通过一定的信号转导通路传递，转录因子抑制或激活，启动关键基因表达的结果。-2-第四军医大学硕士学位论文本研究的目标是：探索不同微环境下对大鼠 MSCs 体外分化为 IPCs 的影响，在糖尿病大鼠体内微环境下 MSCs 是否还可以分化为 IPCs，为糖尿病细胞替代治疗提供理想的种子细胞。大鼠 MSCs 的体外分离培养和生物学特征：利用贴壁法分离纯化大鼠MSCs，传代培养于含 10胎牛血清的 DMEM 培养液中；通过倒置显微镜、电镜、免疫细胞化学分析大鼠 MSCs 的生物学特征。结果显示原代和

7、传代培养MSCs 均保持较强的增殖能力，形态为均一的成纤维样细胞。超微结构显示了干细胞的幼稚特征，免疫细胞化学显示 CD34 阴性，CD44 阳性。结论：采用我们的方法，可以获得生长稳定，扩增较快和纯度较高的 MSCs。不同微环境对大鼠MSCs体外分化为IPCs的影响：采用第三代MSCs,用不同的微环境进行诱导，对照组诱导剂为含有角朊细胞生长因子、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）、尼克酰胺的无血清DMEM/F12 培养基、实验组在对照组基础上添加胰腺条件培养液；对诱导后细胞进行光、电镜观察，双硫腙和免疫细胞化学等进行鉴定,并行体外葡萄糖刺激实验,测定细胞分泌胰岛素及C-肽功能。结果表明，实验组及对

8、照组均可诱导分化为IPCs，但实验组分化而成的IPCs在数量及功能上均好于对照组。结论：大鼠胰腺提取物模拟的微环境能促进大鼠MSCs体外诱导分化为较高质量的IPCs。在糖尿病大鼠体内微环境下MSCs分化为IPCs的潜能：通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导健康SD大鼠建立糖尿病模型；将MSCs及由MSCs诱导分化来的IPCs注射到糖尿病模型大鼠的肾包膜下，检测移植前后血糖、体重、尿量、生存时间变化，当移植大鼠血糖开始下降后，行荷移植物肾切除术去除移植物，继续观察血糖变化，看是否有血糖反跳，以评价其治疗糖尿病的效果，结合标本免疫组织化学染色，观察移植入的MSCs在糖尿病大鼠体内是否分化为IPCs

9、。结果：将MSCs及IPCs移植到大鼠肾包膜下后，大鼠的血糖水平下降，糖尿病症状得到控制，生存时间明显延长。免疫组化显示移植入的MSCs分化为胰岛素染色阳性细胞。结论：在糖尿病大鼠体内微环境下MSCs可以分-3-第四军医大学硕士学位论文化为IPCs。综上所述，大鼠 MSCs 在不同的体外及体内微环境下均可特异诱导分化为 IPCs,而大鼠胰腺提取物模拟的微环境能促进大鼠 MSCs 体外诱导分化为IPCs；将大鼠 MSCs 和 IPCs 移植入糖尿病大鼠模型体内能够明显改善糖尿病症状，延长其生存时间。虽然骨髓间充质干细胞在安全而有效地运用于临床治疗之前还有许多基本的问题有待解决，但它为我们解决移植

10、治疗糖尿病中供体缺乏问题方面提供了一条新的途经。关键词：骨髓间充质干细胞，产胰岛素细胞，糖尿病，微环境，移植。-4-第四军医大学硕士学位论文The Impact of Different Microenvironments on the Rat Bone MarrowMesenchymal Stem Cells differentiating into Insulin-producing CellsCandidate for master: Huang ShengSupervisor: Prof.Dou Kefeng，Prof.Song ZhenshunDepartment of Hepato

11、biliary Surgery, Xi Jing hospital, Fourth Military MedicalUniversity,Xian710032, ChinaAbstractDiabetes mellitus is a devastating chronic disease and over 6% of thepopulation is affected worldwide. The diabetic are necessary to inject insulin intheir lifetime, but it is not ideal to inject insulin si

12、nce insulin can't prevent thedevelopment of diseases derived form diabetes, such as kidney diseases, coronaryheart disease, eye diseases,etc. The success achieved over last few years with islettransplantation suggests that diabetes can be cured by the replenishment ofdeficient cells. However, th

13、e lack of donor organs and transplant rejectionhinder the application of pancreatic islet transplantation.Stem cells ,which have the capacity for both self-renewal and multilineagedifferentiation into any type of cell, becoming the new source of islet cellreplacement. Bone marrow mesenchymal stem ce

14、lls(MSCs) have great ability ofmulti-directional differentiation and reproductive activity that make thempotentially useful for cell therapy. A number of protocols have been described toinduce MSCs to neuronal cells,adipocytes,smooth muscle myocytes,skeletalmuscle myocytes,cartilage cells and insuli

15、n-producing cells(IPCs).The IPCs-5-第四军医大学硕士学位论文induced from MSCs can secrete insulin,but their secretory volume was less than1% that of a normal cells. How to promote MSCs differentiating into IPCsbecome the critical issue should be solved. The recent study have shown that thedifferentiation mechani

16、sm is the result of key gene expression through a definitesignal transmitting passway and inhibition or activation of transcription factorinduced by microenviroment factorsIn this study，we try to explore the impact of different microenvironmenton differentiating rat bone marrow MSCs into IPCs in vit

17、ro,then to study thecapacity of MSCs differentiating into IPCs in diabetic rats microenviroment invivo,and to provide suitable “seed” cells for replacement therapy of diabetesmellitus.Isolation, cultivation and biological features of rat MSCs in vitro：MSCs were isolated from rat bone marrow，purified

18、 by their adhesive processonto the culture dish，serial subcultivated on dulbeccos modified eagle mediumwith 10% fetal bovine serum ； The changes of cell morphology and theultrastructure were observed, cell surface markers CD34、CD44 were detected byimmunocytochemistry. The results show both primary a

19、nd passage MSCs havemaintained highly proliferative capacity.They have homogeneous fibrocyte-likeshap under light microscope. The ultrastructure showed the young cell nature ofstem cell. The cells were negative for CD34, while positive for CD44 byimmunocytochemistry staining.Conclusion: MSCs can be

20、cultured stably、expanded quickly and have higher purity with our method.The Impact of different microenvironments on the differentiating ratMSCs into IPCs: Third descended MSCs cells were then cultivated in vitromimicking different microenvironments，in which control group was cultivated inserum free

21、 DMEM/F12 medium including keratinocyte growth factor(KGF)、ITSand Nicotinamide, while experimental group was cultivated in serum free-6-第四军医大学硕士学位论文DMEM/F12 medium in which the rat pancreatic extract was added. During thecultivation period the cells were taken for light and electron microscopy atdif

22、ferent time points, identified by dithizone(DTZ) and immunocytochemistry.The glucose stimulation test was performed in vitro and the levels of insulin andC-peptide in response to the different glucose concentration was assayed. Theresults show MSCs could differentiat into IPCs both in the control gr

23、oup and theexperimental group. The IPCs harvested from experiment group had greaternumber and better function than that from control group . Conclusion :Themicroenvironment in which the rat pancreatic extract added could promote the ratbone marrow MSCs to differentiate into better IPCs in vitro。The

24、capacity of MSCs differentiating into IPCs in diabetic ratsmicroenviroment in vivo： The rat MSCs and IPCs induced from MSCs weretransplanted under the renal capsule of STZ induced SD rat. Blood glucose levels,weight, urine and survival rate were monitored. when rats blood glucose levelsbegin to desc

25、end，grafts were then removed by unilateral nephrectomy. The bloodglucoses level was monitored to investgate whether euglycemia reversalhappenned, and we have immunohistochemistry staining to observe wheretherthe MSCs of transplanted could differentiate into IPCs. The result show MSCsand IPCs by inje

26、ction into the renal capsule of STZ induced diabetic SD rat coulddecreaseitsbloodglucoselevelandprolongedsurvivaltime.Immunohistochemistry also confirmed that the MSCs of transplanted werestrongly positive for insulin. Conclusion: MSCs can differentiating into IPCs indiabetic rats microenviroment in

27、 vivo.In summary, the present study provides evidence that rat MSCs have thecapacity to differentiate into IPCs under different microenvironments both invitro and in vivo. The microenvironment in which the rat pancreatic extract addedcould promote the rat bone marrow MSCs to differentiate into bette

28、r IPCs in vitro.-7-第四军医大学硕士学位论文MSCs and IPCs transplanted into the renal capsule of STZ induced diabetic SDrats could decrease their blood glucose level and prolong their survival time.Obviously, there are still a number of fundamental questions about MSCs need tobe answered before they can be safel

29、y and effectively used in clinical setting, butit provides us a new solution to deal with the shortage of beta cells for therapy oftype 1 diabetes.Key words：Mesenchymal stem cells；Insulin-producing cells；Microenvironment；Diabetes；transplant-8-第四军医大学硕士学位论文前言糖尿病是严重危害人类健康和生命的常见内分泌代谢性疾病，近年来其患病率在全球呈现快速增长

30、的趋势，在大多数国家已成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病。目前几乎所有I型糖尿病和部分II型糖尿病患者都需要长期注射胰岛素治疗，常规治疗方案发生全身血管并发症的危险性较高，而强化治疗方案虽可使糖尿病并发症的危险性降低，但却不能完全避免其发生，且容易出现低血糖反应甚至昏迷而危及生命1,2。胰岛移植为糖尿病人带来了曙光，理论上胰岛移植成功后不但能有效的控制血糖，而且可以恢复胰岛正常的生理功能，维持糖代谢内环境稳定，从根本上提高型糖尿病患者3效果，主要原因在于每个受者需要 2 个以上的供体，而供体数量又极其有限胰岛移植物的质量和数量难于控制移植物免疫排斥反应胰岛移植并不能延缓自身免疫反应的进展。

31、如何解决这些问题，尤其是移植物短缺问题，成为提高胰岛移植，甚至细胞移植成功率的关键。随着干细胞研究的不断深入，定向诱导干细胞分化为产胰岛素细胞甚至胰岛成为近年研究的热点。干细胞是具有自我更新和多潜能分化能力的细胞。干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞分化潜能较高,其诱导分化为胰岛素分泌细胞可能性很大。但胚胎干细胞的来源受伦理的限制,且有成瘤性的危险。成体干细胞在来源和克服免疫排斥上有一定优势。但因为干细胞只占胰腺的很少部分,来源有限，自我更新、不断增殖的能力有限,诱导分化得到的细胞分泌胰岛素的量很少,目前还难以成为细胞治疗的种子细胞。由于骨髓间充质干细胞（MSCs）取材容易，增殖能力强

32、，具有多向分化潜能，且免疫原性弱，移植后不致瘤性，可作为细胞替代治疗、组织工程和基因工程的理想的种子细胞。近来MSCs诱导分化胰岛样细胞并治疗糖尿病的研究已经取得了一些成就。-9-的生活质量 。但是经过多年的临床应用，胰岛移植并没有达到预期的治疗第四军医大学硕士学位论文4细胞。Ianus等5通过将骨髓来源的干细胞移植到受体鼠内,能分化成具有胰腺细胞表型的细胞。能表达胰岛细胞标志，并对高血糖产生反应,分泌胰岛素，但是其体外分化为胰岛效率低，胰岛素分泌量低，远远不能满足移植治疗糖尿病的需要是不争的事实。如何提高骨髓间充质干细胞诱导分化为胰腺内分泌细胞的能力成为近来研究重点。在干细胞分化中有一重要学

33、说：微环境诱导分化学说，认为指导转录因子及启动基因表达的信号可能存住于干细胞生存的微环境，即“干细胞龛”中。在微环境中，间充质干细胞通过与其他细胞、细胞基质及各种细胞因子、激素的相互作用，引起调控间充质干细胞分化的某些关键基因表达，决定分化的方向6。Choi 等证实在行部分胰腺切除术后,新生的胰腺组织可能含有某些因子和激素能有助于MSCs向IPCs分7本研究制备大鼠的胰腺组织提取物模拟MSCs分化的体内微环境，观察其是否能促进MSCs在体外诱导分化为IPCs，用双硫腙染色阳性细胞率进行比较,用高糖刺激试验检测转分化所得IPCs分泌胰岛素的功能;并将MSCs及诱导分化来的IPCs移植入糖尿病大鼠

34、体内下,观察其在体内微环境下能否控制糖尿病模型大鼠血糖。从而建立一种较好的诱导方案及微环境，能体外诱导MSCs分化为IPCs；并探讨MSCs在体内微环境下对血糖控制的功能及机制，为克服胰岛移植的供体短缺提供新的胰岛来源，为干细胞治疗糖尿病提供实验依据和新的解决途径。-10-2003年 Hess ，研究发现骨髓间充质干细胞体外能横向分化为产生胰岛素的化 。第四军医大学硕士学位论文文献回顾第一部分干细胞治疗糖尿病研究进展胰岛细胞移植是目前治疗I型糖尿病的一个热点，但是胰岛细胞来源的匮乏和存在免疫排斥反应阻碍了这种方法的广泛应用，寻找胰岛细胞新来源已成为全球糖尿病研究的热点之一。干细胞具有自我更新和

35、定向分化的特征使干细胞治疗糖尿病成为近年来研究的一个主要方向。1、糖尿病( Diabetes mellitus ,DM)糖尿病是一种以持续性高血糖为特征的全身性内分泌代谢疾病，细胞是产生胰岛素并使体内的营养物质保持平衡，糖尿病患者无法产生适量的胰岛素满足机体的需要或机体不能正常利用胰岛素，从而引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，导致血糖水平升高、进而诱发心脑血管疾病和肾功能衰竭的发生。世界卫生组织估计到2025年全球糖尿病患者将超过3亿。1.1 分型1997 年美国提出将原发性 DM 分为两型的方案，即将易发生酸中毒、胰岛素绝对缺失、必须依赖外源性胰岛素延续生命者归为型（Insulindepende

36、nt diabetes mellitus，IDDM）;不依赖外源胰岛素延续生命者归为型(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)。临床上诊断 DM以型为多数 。1.2 病因IDDM：属器官特异性自身免疫性疾病，即其免疫系统错误地把胰脏中产生胰岛素的细胞当作外来入侵者而加以破坏。其发病原因尚不清楚，其中遗传、自身抗体、病毒、营养等因素与其发病有关，它们使单核-巨噬细胞产生白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子-（TNF-），从而介导细胞坏死，导致胰岛细胞破坏，免疫功能异常。循环中的各种自身免疫抗体（如-11-第四军医大学硕士学位论文ICA、I

37、AA、GAD 等）可作为 IDDM 的免疫学标志。同时细胞的破坏产生自身抗原及淋巴侵润，刺激特异性自身免疫反应，使胰岛细胞进一步破坏，胰岛素合成与释放减少，最终导致 IDDM。所有的型糖尿病的患者需要每天注射胰岛素进行治疗。应用多次小剂量的链脲霉素（Streptozotocin,STZ）8NIDDM：美国糖尿病联合会认为型糖尿病是最常见的糖尿病，它包括单基因型的青年人发作型糖尿病（Maturity Onset Diabetes of Youth, MODY）9其发病与基因和非基因因素相关，遗传和环境因素在 NIDDM 的发生中均有重要作用10。其发病率随年龄的增加而增加，通常与胰岛素抵抗、胰岛

38、素相对或绝对不足相关，病人的存活通常不需要胰岛素的治疗。NIDDM治疗方法为口服降糖药，增加内源性胰岛素的分泌，降低胰岛素抵抗，或通过延缓各种碳水化合物的吸收，降低外周血糖。NIDDM 的中、长期血糖控制需要口服降糖药渐进性的联合治疗，20-30%的型糖尿病患者在口服高血糖抑制剂无效后，也需要胰岛素控制高血糖，采用口服降糖药和胰岛素的联合治疗。1.3 治疗糖尿病是世界范围最常见的流行性疾病之一，其死亡率仅次于心血管疾病，恶性肿瘤。该病是由于胰岛素在体内的绝对或相对不足而引起的糖，脂肪及蛋白质代谢紊乱的疾病。目前型糖尿病常规治疗方法是应用外源性胰岛素注射控制血糖。但常规治疗方案发生全身血管并发症

39、的危险性较高，而强化治疗方案虽可使糖尿病并发症的危险性降低，但却不能完全避免其发生，且容易出现低血糖反应甚至昏迷而危及生命，而且患者难免遭受注射所带来的不便和痛苦。细胞替代治疗法（即补充细胞或产胰岛素细胞，如胰岛移植）较目前临床常用的胰岛素治疗有一定的优势。迄今为止最成功的胰3格兰医学杂志上报告应用一套被称为“Edmonton方案”的胰岛移植方法，对-12-制作的型糖尿病模型能够证实细胞凋亡是细胞死亡的主要机制 。和多基因型代谢紊乱（典型的 NIDDM）等表型 。NIDDM 属一种异质性紊乱，岛移植的临床报告来自于加拿大Edmonton中心 ，该中心在2000年7月的新英第四军医大学硕士学位论

40、文连续7 例有严重低血糖史及代谢不稳定史的型糖尿病患者进行胰岛移植，同时进行无糖皮质类固醇的免疫抑制治疗。分离胰岛的方法为经导管用纯化的冷胶原酶灌注并消化,在无异种蛋白的介质中纯化,然后用经肝门脉穿刺注射法立即移植。移植后7 名患者均实现了胰岛素自给，未再发生低血糖昏迷,在随访过程中患者的血脂水平无显著升高。至今全球超过50个中心重复Edmonton的治疗方案治疗了超过500个型糖尿病患者。但一些难以克服的困难限制了这种方法的推广:（1）免疫排斥问题，异体胰岛移植后患者需要终身使用免疫抑制剂，而长期使用免疫抑制剂将有可能对其机体造成极大危害;（2）供体数量不足，根据“埃德蒙顿方案”，每个糖尿病

41、患者胰岛移植治疗至少需要2个供体胰腺，而事实上根据器官共享联合网的报告11，美国每年能够获得的尸体胰腺不超过6000个，而根据青少年糖尿病基金会估计，其每年被诊断为型糖尿病的新病例就多达30000例,因此在美国胰岛移植如今仅限应用于少数严重低血糖史及代谢不稳定型的I型糖尿病患者；（3）疗效不持久：据国际胰岛移植中心登记，截至到2000年，胰岛移植一年以后仅8.2患者无需再使用胰岛素12。一些替代胰岛移植的方法包括异种胰岛移植、异体胰腺移植、可分泌胰岛素细胞株的建立等方法曾先后出现。从异种动物的体内获得可供移植的器官和组织也是目前使用的一种方法。猪被认为是最理想的器官来源，因为猪的器官大小、结构

42、与人类的非常相似。近来猪胰岛异种移植已获成功并有望用于临床13。但异种移植的一个潜在危险是接受移植的病人可能会感染上猪体内的内源性逆转录病毒，从而传播危害人类健康的种属交叉疾病14。异种移植的另一个巨大障碍是其免疫排斥反应远比同种异体移植物要大的多，这往往导致移植入的胰岛细胞在数日内丧失功能。异体胰腺移植是一技术较复杂的大手术，术后并发症发生率高15。利用内分泌肿瘤细胞或特殊胰腺内分泌细胞可以建立起分泌胰岛素的细胞株，Knaack报道胰岛素瘤细胞TC6-F7可以连续传代55代以上，超过一年仍正常分泌胰岛素16；取自高胰岛素低血糖-13-第四军医大学硕士学位论文综合征患者的细胞株NISK9，转染

43、相应的缺陷基因后能正常分泌胰岛素，但是这些细胞株表型不稳定，易丧失分泌胰岛素的功能。因此寻找胰岛细胞的新来源己成为关注的焦点。因干细胞具有自我更新和定向分化的特性而成为解决细胞来源问题的研究热点，人们试图探索用多种方法通过细胞的遗传工程或通过利用各种潜在的细胞前体细胞干细胞在体外培养诱导分化为胰岛素细胞。近年来关于啮齿类动物和人类起源的各类干细胞治疗糖尿病的研究已经得到了可喜的成绩。2、干细胞研究概述干细胞是个体发育过程中产生的具有无限或较长时间自我更新和多向分化能力的一类细胞。干细胞有以下特点：（1）干细胞本身不是终末分化细胞（即干细胞不是处于分化途径的终端）；（2）干细胞能无限增殖分裂；（3）干细胞可持续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；（4）干细胞分裂产生的子细胞只能在两种途径中选择其一，或保持亲代特征，仍作为干细胞；或不可逆的向终末分化。根据分化潜能的大小，干细胞基本上可以分为三种类型。（1）全能性干细胞（Totipo