不同链长RGD多肽对交联PEI体外细胞转染的影响

1、第5卷第6期2010年6月415不同链长RGD多肽对交联PEI体外细胞转染的影响孙云霞,曾 旋,张先正,卓仁禧(武汉大学化学与分子科学学院生物医用高分子材料教育部重点实验室,武汉 430072摘 要:用固相合成法合成了两种不同链长的含RGD序列的小分子多肽,分别为RGD和GGGGRGDS。用物理共混法制备了含RGD的SS-PEI/DNA复合物。测定了该复合物的电位,研究了RGD的链长和加入量对SS-PEI/DNA复合物在COS-7和CHO中的转染效率的影响。结果表明,由于RGD上的天冬氨酸带负电荷,因此含RGD的复合物电位略有降低。RGD链长对复合物在两种细胞系中的转染影响不大,在COS-7中

2、RGD的转染效率略高于GGGGRGDS,而在CHO 中则相反,且随着多肽用量的增加转染效率略有降低。关键词:基因载体;交联聚乙烯亚胺;多肽;RGD中图分类号:R943.4文献标志码:A 文章编号:1673-7180(201006-0415-4Effect of RGD peptide chain length on gene transfection efficiency ofcross-linked PEISun Yunxia,Zeng Xuan,Zhang Xianzheng,Zhuo Renxi(Key Laboratory of Biomedical Polymers of Minis

3、try of Education & Department of Chemistry, Wuhan University,Wuhan 430072, ChinaAbstract: Two RGD peptides with different chain lengths, RGD and GGGGRGDS, were synthesized via solid-phase synthesis. In order to enhance biological activities, the RGD peptides were noncovalently introduced into SS

4、-PEI/DNA complex. The effects of RGD chain length and addition on zeta potential and transfection efficiency were investigated. The results showed that aspartic acid in RGD carried negative charges could reduce the zeta potential of complex. RGD chain length had slight influence on transfection effi

5、ciency. Complex with RGD presented higher transfection efficiency than complex with GGGGRGDS in COS-7 cells, which was different from that in CHO cells. Moreover, transfection efficiency was slightly decreased with the increasing of peptide addition.Key words: gene vector;cross-linked PEI;peptide;RG

6、D对于靶向基因传递体系,受体介导的内吞是载体/DNA复合物进入细胞的主要途径。已经发现的受体包括铁传递蛋白受体、脱唾液酸糖蛋白受体以及整合素受体1-5。而和整合素受体特异性结合的靶向配体是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD序列的多肽,这种配体可以特异性识别细胞表面的v3和v5整合素受体(如内皮细胞、破骨细胞、巨噬细胞等6-9。靶向配体和细胞表面受体的相互作用会引起受体介导的细胞内吞,因此,整合素受体常被用来研究细胞的黏附及基因传递系统通过受体介导内吞进入细胞的过程10。将RGD配体与转染效率较高的聚乙烯亚胺(PEI结合起来,可进一步提高细胞对PEI的内吞作用,大幅降低材料对细胞的毒性。然而,采

7、用化学键合会降低RGD多肽的生物活性,甚至使其完全失活。为了保收稿日期:2010-03-02基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(2006048600中国科技论文在线SCIENCEPAPER ONLINE第5卷第6期2010年6月416 中国科技论文在线SCIENCEPAPER ONLINE持其生物活性,本实验采取直接物理混合的方式在二硫键交联聚乙烯亚胺(SS-PEI/DNA基因传递系统中引入RGD,并研究了多肽的链长和加入量对体外细胞转染效率的影响。1实验部分1.1试剂氨基被9-芴甲氧羰基保护的甘氨酸(FMOC-Gly-OH、氨基以及侧基的羧基分别被9-芴甲氧羰基和叔丁基保护的天

8、冬氨酸(FMOC-Asp(OtBu-OH、氨基以及侧基的胍基分别被9-芴甲氧羰基和2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺酰基保护的精氨酸(FMOC-Arg(Pbf-OH、氨基以及侧基的羧基分别被9-芴甲氧羰基和叔丁基保护的丝氨酸(FMOC-Ser(OtBu-OH、苯并三氮唑-N,N,NN-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU、1-羟基苯并三氮唑(HOBt、二氯甲基树脂(2-chlorotrityl chloride resin购于上海吉尔生化公司。三异丙基硅烷(TIS、苯甲硫醚(MPS购于Acros公司。乙二硫醇(EDT、无水乙醚、三氟乙酸(TFA、哌啶、茚三酮、苯酚为分析纯。二异丙基乙胺

9、(DIEA重新蒸馏后使用。N,N-二甲基甲酰胺(DMF和二氯甲烷(DCM用无水MgSO4干燥蒸馏后使用。SS-PEI为实验室自制10,由无细胞毒性的枝化PEI(800 Da通过SS键交联得到,产物分子量为9.65 kDa。1.2两种不同链长的RGD多肽(RGD、GGGGRGDS的制备称取1.5 g三苯甲基氯树脂(2-chlorotrityl chloride resin至多肽合成装置(aldrich fritted filter funnel中, DMF浸泡树脂使之充分溶胀,排出DMF。称取1.63 g (3.96 mmolFMOC-Asp(OtBu-OH,用10 mL DMF将其溶解后转入多

10、肽合成装置中,加入3.3 mL二异丙基乙胺(DIEA,室温搅拌1.5 h。用4×10 mL DMF洗涤树脂。加入13 mL 体积分数20 %的哌啶/DMF溶液到树脂中,反应2 h,脱去Asp上的FMOC保护基。4×10 mL DMF洗涤树脂,用茚三酮检验脱保护是否完全。分别称取1.18 g(3.96 mmolFMOC-Gly-OH, 1.8 g (4.752 mmolHBTU,0.64 g (4.752 mmolHOBt,用10 mL DMF溶解后转入多肽合成装置中, 加入2 mL DIEA,缩合反应1.5 h。4×10 mL DMF洗涤树脂。加入13 mL体积分

11、数20%的哌啶/DMF溶液到树脂中,反应2 h,脱去Gly上的FMOC保护基。4×10 mL DMF洗涤树脂,用茚三酮检验脱保护是否完全。分别称取2.57 g (3.96 mmolFMO C-Arg(Pbf-O H,1.8 g(4.752 mmol HBTU,0.64 g (4.752 mmol HOBt,用10 mL DMF溶解后转入多肽合成装置中,加入2 mL DIEA,缩合反应1.5 h。用4×10 mL DMF洗涤树脂。加入13 mL体积分数 20%的哌啶/DMF溶液到树脂中,反应2 h,脱去Arg上的FMOC保护基。4×10 mL DMF洗涤树脂,用茚三

12、酮检验脱保护是否完全。4×10 mL DMF 洗涤树脂。再用4×10 mL CH2Cl2洗涤树脂,充分洗干,于真空干燥箱中干燥24 h。将30 mL TFA、0.8 mL H2O、0.3 mL TIS、0.8 mL MPS、0.8 mL EDT、0.8 mL 苯酚的混合液加到干燥后的树脂中,反应8 h。收集滤液TFA,用少量TFA洗树脂,收集洗液,合并滤液和洗液,用适量的无水乙醚进行沉淀,静置。沉淀充分后,抽滤,洗涤,干燥,得粗产品。粗产品溶于水,冻干,制得RGD。GGGGRGDS的合成方法同RGD。1.3细胞培养及质粒DNA的纯化中国仓鼠卵巢细胞(CHO和非洲绿猴肾细胞(

13、COS-7 用含10%胎牛血清(FBS、2 mg/mL NaHCO3和1% 10 000 U/mL的双抗(青霉素链霉素的DMEM(Gibco 培养基在37 、5% CO2培养箱中培养。本实验使用了萤光素酶(pGL-3报告基因质粒。pGL-3在JM109大肠杆菌中转化。采用Omega公司的无内毒素质粒大提试剂盒,从菌液中提取和纯化质粒DNA,用超纯水洗脱,无菌过滤,所得质粒DNA的水溶液冻存于-80 。1.4含多肽的SS-PEI/DNA复合物的制备将两种多肽、SS-PEI和质粒DNA(pGL-3分别溶于去离子水中,配成质量浓度分别为2 mg/mL、1 mg/mL 和500 ng/L的水溶液。将质

14、量比为10的SS-PEI/DNA 复合物37 下静置30 min,然后将不同用量的多肽溶液加入SS-PEI/DNA复合物中继续静置30 min,得到含多肽的SS-PEI/DNA复合物。1.5电位的测定加入含RGD或GGGGRGDS的SS-PEI/DNA复合物,用Nano-ZS ZEN3600(Malvern Instruments测定复合物的电位。1.6体外转染将中国仓鼠卵巢细胞(CHO和非洲绿猴肾细胞(COS-7以每孔细胞数6×105接种于24孔板,培养24 h,分别加入含RGD或GGGGRGDS的SS-PEI/DNA复合物(SS-PEI与DNA的质量比为10,每孔1g质粒,孵育4

15、 h后,吸弃旧液,加入新鲜培养液继续在37 、5% CO2培养箱中培养48 h。用化学发光仪定量检测细胞中荧光素酶的表达。第5卷 第6期 2010年6月 4172 结果与讨论2.1 多肽的合成为了考察不同肽链长度的多肽对SS-PEI/DNA 复合物转染效率的影响,利用固相合成法制备了含RGD 序列的两种小分子多肽RGD 和GGGGRGDS ,结构如图1所示。图1 RGD 多肽结构 Fig. 1 Structure of RGD peptides2.2 复合物的电位复合物的电位测试结果如图2所示。由图2可以看到随着两种多肽加入质量的逐渐增加,复合物的电位逐渐降低,尤其是当RGD 的加入量为120

16、 µg 时,复合物电位降至13.6 mV 。这是由于RGD 中的天冬氨酸带一定的负电荷,随着RGD 质量的增加,天冬氨酸的含量也随之增多,因而屏蔽了复合物上的部分正电荷。总的来说,虽然多肽的加入使复合物表面电荷降低,但是仍带较强的正电性,能与带负电的DNA 以及细胞膜结合,有助于细胞对复合物的内吞,对转染效率影响较小。图2 多肽链长和加入量对复合物电位的影响 (以SS-PEI/DNA (质量比为10复合物的电位为参照 Fig. 2 Effect of chain length and amount of peptide on the complex zeta potential (S

17、S-PEI/DNA complex (mass ratio 10as control2.3 体外转染以复合物SS-PEI/DNA (质量比10的转染效率为参照,考察了两种链长的RGD 对SS-PEI/DNA 复合物在COS-7和CHO 两种细胞系中的转染效率的影响,如图3所示。转染结果表明,当多肽加入量为60 g 时,RGD/pGL-3复合物在COS-7细胞中的转染效率为2.47×1010RLU/mg 蛋白,与之对应的GGGGRGDS/pGL-3复合物的转染效率为1.63×1010 RLU/mg 蛋白。两者未表现出统计学差异显著性,比未加多肽的复合物的转染效率(1.08&#

18、215;1010 RLU/mg 蛋白略高。此外,复合物在COS-7细胞中的转染效率均高于在CHO 细胞中的转染效率。对于CHO 细胞,随着多肽用量的增加,转染效率略有降低。因此,由转染结果可知,对于SS-PEI/DNA 基因传递体系,RGD 多肽的链长和加入量对转染效率无显著影响。(a COS-7细胞不同链长RGD 多肽对交联PEI 体外细胞转染的影响第5卷第6期2010年6月418 中国科技论文在线SCIENCEPAPER ONLINE (b CHO细胞图3复合物的体外转染效率Fig. 3In vitro gene transfection3结 论合成了两种不同链长的RGD多肽(RGD和GG

19、GGRGDS,将不同用量的多肽与SS-PEI/DNA复合物复合后进行体外细胞转染,评价了RGD多肽的链长和用量对转染效率的影响。结果表明,含RGD的复合物电位略有降低,RGD链长和加入量对SS-PEI/DNA 复合物在两种细胞系中的转染影响不显著。参考文献(References1Decuzzi P, Ferrari M. The role of specific and non-specificinteractions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles J.Biomaterials, 2007, 28(18: 2915-2922

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