干细胞和组织再生医学细胞生物学

1、干细胞和组织再生医学细胞生物学n再生再生(regeneration)指生物体受损后的组织指生物体受损后的组织或器官的重新形成已失去部分的过程。或器官的重新形成已失去部分的过程。 组织修复组织修复/ /组织再生组织再生自然界中生物的再生现象自然界中生物的再生现象n将水螅切断后，断面能够识别头部或者尾部的位置，如果将水螅切断后，断面能够识别头部或者尾部的位置，如果切掉的是头，头部将在该位置再生；如果切掉的是尾，尾切掉的是头，头部将在该位置再生；如果切掉的是尾，尾巴将在该位置再生。巴将在该位置再生。n蝾螈的四肢、壁虎的尾巴都具有自然再生的能力蝾螈的四肢、壁虎的尾巴都具有自然再生的能力n人体组织也有再

2、生现象。人体组织也有再生现象。 细胞的再生细胞的再生n物种的再生能力与组织和器官的分化程度相反。物种的再生能力与组织和器官的分化程度相反。n肌体的再生和细胞的修复均由肌体的再生和细胞的修复均由干细胞干细胞来补充。来补充。 组织干细胞保持着自我更新和分化的潜能，维持组织器官的稳态平衡。组织干细胞保持着自我更新和分化的潜能，维持组织器官的稳态平衡。干细胞干细胞 stem celln干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能够干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。n个体发育的不同阶段不同组织中均存在。个体发育的

3、不同阶段不同组织中均存在。n随发育的进程其数量和分化潜能逐渐降低。随发育的进程其数量和分化潜能逐渐降低。n它的主要功能是控制和维持细胞的再生。它的主要功能是控制和维持细胞的再生。按分化潜能可将干细胞分为按分化潜能可将干细胞分为n全能干细胞全能干细胞(totipotent stem cell) ：任何一个细胞都可以发任何一个细胞都可以发育成一个完整个体，如受精卵桑葚胚育成一个完整个体，如受精卵桑葚胚n多能多能 干细胞干细胞(pluripotent stem cell) ：可以分化为来自内、可以分化为来自内、中、外三个胚层的各种细胞，如内细胞团中、外三个胚层的各种细胞，如内细胞团n专能干细胞专能干

4、细胞(multipotent stem cell )：如上皮组织基底层的如上皮组织基底层的干细胞、干细胞、造血干细胞造血干细胞n单能干细胞单能干细胞（unipotent stem cell ：如表皮干细胞如表皮干细胞按发生学来源可将干细胞分为按发生学来源可将干细胞分为n胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC) 、生殖干细胞生殖干细胞(germline stem cell )和成体肝细和成体肝细胞胞（adult stem cell ） 组织干细胞组织干细胞tissue specific stem cell人类胚胎干细胞人类胚胎干细胞n成体干细胞成体干细胞(adult

5、 stem cell )：出现在已特化的组织中：出现在已特化的组织中的未分化的细胞，能够自我更新，并且能分化产生的未分化的细胞，能够自我更新，并且能分化产生该组织的各种特化类型的组织细胞。该组织的各种特化类型的组织细胞。An adult stem cell collected from human bone marrow干细胞的生物学特征干细胞的生物学特征n干细胞具有未分化或低分化特性，多向分干细胞具有未分化或低分化特性，多向分化潜能。化潜能。n干细胞具有干细胞具有“无限无限”的自我更新能力。的自我更新能力。 n 可连续分裂几代，也可在较长时间内处于可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态

6、。静止状态。干细胞的形态及生化特征干细胞的形态及生化特征形态：体积小、核大、细胞器不发达形态：体积小、核大、细胞器不发达生化：干细胞的共同标志，如端粒酶活性生化：干细胞的共同标志，如端粒酶活性 不同干细胞的特有标志，如人造血干细胞表现为不同干细胞的特有标志，如人造血干细胞表现为CD34CD34和和 CD133CD133 ；上皮干细胞有高表达的；上皮干细胞有高表达的11整合素，可介导干细胞与细胞外基质整合素，可介导干细胞与细胞外基质粘附从而抑制其分化的发生粘附从而抑制其分化的发生；神经干细胞神经干细胞 NestinNestin、CD133CD133和和CD24CD24等等n本质特征：具有增殖和自

7、我更新能力以及本质特征：具有增殖和自我更新能力以及在适当条件下表现出一定的分化潜能。在适当条件下表现出一定的分化潜能。独特的增殖特性独特的增殖特性n分裂的周期性慢，绝大多数干细胞处于分裂的周期性慢，绝大多数干细胞处于G0期。进入分化程序时先经过一个短暂的增期。进入分化程序时先经过一个短暂的增殖期，形成过渡放大细胞（殖期，形成过渡放大细胞（transit amplifying cell）n意义：缓慢增殖有利于对外界信号做出反应，减少发意义：缓慢增殖有利于对外界信号做出反应，减少发生基因突变的危险，而快速分裂的过渡放大细胞使干生基因突变的危险，而快速分裂的过渡放大细胞使干细胞仅进行较少次数的分裂即

8、可产生较多数量的分化细胞仅进行较少次数的分裂即可产生较多数量的分化细胞。细胞。 增殖有自稳定性增殖有自稳定性n通过自我更新（通过自我更新（self-renewing）和维持自身数量实）和维持自身数量实现自稳定性（现自稳定性（self-maintenance）。）。n在自我更新中，分裂的形式分为对称分裂和不对称分裂。在自我更新中，分裂的形式分为对称分裂和不对称分裂。n对称分裂对称分裂symmetry division：干细胞分裂产生同类：干细胞分裂产生同类型细胞，如两个子细胞都是干细胞或都是分化细胞型细胞，如两个子细胞都是干细胞或都是分化细胞n不对称分裂不对称分裂asymmetry divisi

9、on：干细胞分裂产生不同：干细胞分裂产生不同类型细胞，如两个子细胞中一个是干细胞另一个是分化类型细胞，如两个子细胞中一个是干细胞另一个是分化细胞细胞干细胞有干细胞有可塑性可塑性n在适当条件下，可实现细胞的转分化在适当条件下，可实现细胞的转分化和去和去分化。分化。n转分化转分化（transdifferentiation） ：一种组织类型的干细：一种组织类型的干细胞，在适当条件下分化成另一组织类型的细胞。胞，在适当条件下分化成另一组织类型的细胞。n去分化去分化（dedifferentiation）：干细胞向其前体细胞的：干细胞向其前体细胞的逆向转化。逆向转化。n1999年年Goodell分离出小鼠

10、的肌肉干细胞，分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。n该现象的调控机制目前还不清楚。大多数观点该现象的调控机制目前还不清楚。大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。可能的认为干细胞的分化与微环境密切相关。可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中

11、的调节信号做出反应。从而对新的微环境中的调节信号做出反应。 干细胞微环境干细胞微环境n一系列的干细胞与细胞外所有物质共同构成的细胞生长一系列的干细胞与细胞外所有物质共同构成的细胞生长的微环境的微环境，又称为干细胞巢（，又称为干细胞巢（stem cell niche）。）。n是干细胞维持自我更新和分化潜能的重要场所。是干细胞维持自我更新和分化潜能的重要场所。干细胞微环境包括多种组成成分干细胞微环境包括多种组成成分n信号分子信号分子: :以自分泌或旁分泌的形式影响干细胞的增以自分泌或旁分泌的形式影响干细胞的增殖与分化。殖与分化。n细胞黏附分子细胞黏附分子: :确保干细胞定居于微环境中，并接受信确保

12、干细胞定居于微环境中，并接受信号分子的调节。号分子的调节。n细胞外基质细胞外基质: :对干细胞正常功能的维持提供了重要信号，对干细胞正常功能的维持提供了重要信号，并且可以直接调节干细胞的分化方向。并且可以直接调节干细胞的分化方向。n空间效应空间效应: :空间结构对保持适宜的干细胞数目和干细空间结构对保持适宜的干细胞数目和干细胞的定向分化发挥了重要作用。胞的定向分化发挥了重要作用。 果蝇卵巢干细胞微环境果蝇卵巢干细胞微环境 生殖干细胞生殖干细胞GSC位于卵巢原卵区的顶部，并被三种不同的基质细胞位于卵巢原卵区的顶部，并被三种不同的基质细胞群所包绕：端丝、帽细胞以及内鞘细胞。这三种基质细胞以及基膜群

13、所包绕：端丝、帽细胞以及内鞘细胞。这三种基质细胞以及基膜共同构成微环境，其中帽细胞通过紧密连接固定共同构成微环境，其中帽细胞通过紧密连接固定GSC，与其他基质细，与其他基质细胞产生的细胞信号分子共同调控胞产生的细胞信号分子共同调控GSC的生长和分化。的生长和分化。干细胞需要特殊的微环境才能执行正常的生理功能干细胞需要特殊的微环境才能执行正常的生理功能n如果将造血干细胞从其正常生存的微环境中分离，它们如果将造血干细胞从其正常生存的微环境中分离，它们即丧失了自我更新的能力。即丧失了自我更新的能力。n微环境还能调控干细胞的分化发育方向，在不同信号途微环境还能调控干细胞的分化发育方向，在不同信号途径构

14、成的微环境中，干细胞能向不同的谱系细胞分化。径构成的微环境中，干细胞能向不同的谱系细胞分化。 黄禹锡造假事件黄禹锡造假事件胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)n在人胚胎发育早期在人胚胎发育早期囊胚中含有未分化的细胞。囊胚中含有未分化的细胞。n囊胚含有约囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群（胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群（inner cell mass, ICM） 。n内细胞群在形成

15、内、中、外三个胚层时开内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。各种组织和器官。n当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。为胚胎干细胞。ESC特点特点n可在体外无限培养可在体外无限培养增殖增殖n长期保持原始未分长期保持原始未分化状态化状态n可分化出衍生于可分化出衍生于3胚胚层的各类组织细胞层的各类组织细胞胚胎干细胞可以诱导分化为任何一种组织细胞胚胎干细胞可以诱导分化为任何一种组织细胞ESCESC的获得的获得nThomson的工作的工作: :从人类胚胎的囊胚期内细胞群中

16、从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞。学者们从体外受精临床实直接分离多能干细胞。学者们从体外受精临床实验室得到胚胎，这些胚胎是不育症临床治疗后不验室得到胚胎，这些胚胎是不育症临床治疗后不需要的，用于繁殖，而非研究目的。从捐献者夫需要的，用于繁殖，而非研究目的。从捐献者夫妇处获得知情同意书后，妇处获得知情同意书后，Dr.Thomson分离了内细分离了内细胞群胞群,将这些细胞进行培养，产生一个多能性干细胞将这些细胞进行培养，产生一个多能性干细胞系。系。 nGearhart的工作：从终止妊娠的胎儿组织中分离出的工作：从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞。捐献者自行决定了终止妊娠，从他多

17、能性干细胞。捐献者自行决定了终止妊娠，从他们那儿获得了知情同意书后，们那儿获得了知情同意书后，Dr. Gearheart从胎儿从胎儿原本要发育成生殖腺的部位取得细胞。原本要发育成生殖腺的部位取得细胞。n尽管尽管Dr. Thomson 实验室和实验室和Dr. Gearheart实验室使实验室使用的细胞系来源不同，但发育成熟的细胞看起来非常相用的细胞系来源不同，但发育成熟的细胞看起来非常相似。似。 胚胎生殖细胞胚胎生殖细胞(embryonic germ cell, EG cell ) ：来自于早期胚胎：来自于早期胚胎（5-10周）胎儿生殖嵴的原生殖细胞，也属于多能干细胞。周）胎儿生殖嵴的原生殖细胞

18、，也属于多能干细胞。体细胞核转移体细胞核转移n将一个正常的动物卵细胞去除细胞核（含染色体的细胞将一个正常的动物卵细胞去除细胞核（含染色体的细胞结构）。存留在卵细胞内的物质含营养成分和对胚胎发结构）。存留在卵细胞内的物质含营养成分和对胚胎发育非常重要的能量物质。而后，在非常精细调控的实验育非常重要的能量物质。而后，在非常精细调控的实验室条件下，将单个体细胞室条件下，将单个体细胞除卵细胞或精子细胞之外的除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞任一种细胞与除去核卵细胞放在一起，使两者相融合。与除去核卵细胞放在一起，使两者相融合。融合细胞以及其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能，融合细胞以及其子细胞具有发育

19、成一个完整个体的潜能，因此是全能性的。因此是全能性的。 胚胎干细胞的主要特征胚胎干细胞的主要特征形态：体积小、核大、紧密堆积，无明显细胞形态：体积小、核大、紧密堆积，无明显细胞界限界限生化：胚胎阶段特异性抗原（生化：胚胎阶段特异性抗原（stage-specific embryonic antigen，SSEA） 端粒酶端粒酶活性高活性高分化能力强，可在体外长期培养分化能力强，可在体外长期培养为什么进行胚胎干细胞研究为什么进行胚胎干细胞研究干细胞技术的市场前景干细胞技术的市场前景n研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论

20、上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。优点明显优点明显n应用干细胞治疗疾病较传统方法具有很多优点：应用干细胞治疗疾病较传统方法具有很多优点：n低毒性（或无毒性），一次给药有效；低毒性（或无毒性），一次给药有效； n不需要完全了解疾病发病的确切机理；不需要完全了解疾病发病的确切机理； n还可能应用自身干细胞移植，避免产

21、生免疫排斥反应。还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。n将将ESC注射到裸鼠皮下，小鼠可产生畸胎瘤。分化的胚注射到裸鼠皮下，小鼠可产生畸胎瘤。分化的胚胎组织包括胃上皮组织胎组织包括胃上皮组织(内胚层内胚层),骨和软骨组织、平滑骨和软骨组织、平滑肌和横纹肌肌和横纹肌(中胚层中胚层)，神经表皮、神经节和复层鳞，神经表皮、神经节和复层鳞状上皮状上皮(外胚层外胚层)等。等。n动物模型：嵌合体小鼠动物模型：嵌合体小鼠存在的问题存在的问题nESC的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达，以实现分化抑制，保证细胞的的基因的激活与表达，以

22、实现分化抑制，保证细胞的全能性。全能性。ESC在体外需在饲养层在体外需在饲养层(feeder layer)细胞细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。自发地进行分化。 选择合适培养基，添加选择合适培养基，添加LIF（小鼠（小鼠ES细胞细胞 ） LIF是目前唯一明确的保持小鼠干细胞特性的重要细胞因子，维持其增是目前唯一明确的保持小鼠干细胞特性的重要细胞因子，维持其增殖状态。殖状态。 LIF-STAT信号通路图信号通路图 n如何定向诱导干细胞分化？如何定向诱导干细胞分化？- 细胞分化是多种细胞因子相互作用细胞分化是多种细胞因子相互

23、作用引起细胞一系列复杂的生理生化反应的过程，因而要诱导产生某种特异类型的引起细胞一系列复杂的生理生化反应的过程，因而要诱导产生某种特异类型的组织，需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用组织，需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。n由胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像由胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这如何克服心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这如何克服移植排斥反应移植排斥反应n对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性尚需做对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性尚需做全面、客观、深入的评价。全面、客观、深入的

24、评价。n人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德，应用过程中人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德，应用过程中所产生的伦理及法律问题如何处理。所产生的伦理及法律问题如何处理。 n研究表明人体脂肪、胎盘等组织中的干细胞，具有惊人研究表明人体脂肪、胎盘等组织中的干细胞，具有惊人的可塑性，和胚胎干细胞一样，可以分化成各种各样的的可塑性，和胚胎干细胞一样，可以分化成各种各样的组织细胞，可以通过诱导使成体干细胞进行特化发育，组织细胞，可以通过诱导使成体干细胞进行特化发育，然后将其移植回病人体内，这样既可以避免发生排斥现然后将其移植回病人体内，这样既可以避免发生排斥现象，也可以避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的

25、干细象，也可以避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的干细胞。胞。成体干细胞的不足之处：成体干细胞的不足之处：n人们尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞，例如人们尚未人们尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞，例如人们尚未发现人类的成体心脏干细胞。发现人类的成体心脏干细胞。n成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低。降低。n在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植。细胞中，这样的干细胞不适于移植。n成人身上获得的干细胞可能没有年轻

26、人的干细胞那样的增殖能力。成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力。n由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等。异常等等。 iPS细胞（细胞（induced pluripotent stem cells）n2006年年Yamanaka发现，胚胎干细胞中存在一系列特发现，胚胎干细胞中存在一系列特异性表达的蛋白质，而当胚胎干细胞分化时，这些蛋白异性表达的蛋白质，而当胚胎干细胞分化时，这些蛋白表达减少。提出如果在小鼠

27、体细胞内表达这些蛋白，或表达减少。提出如果在小鼠体细胞内表达这些蛋白，或许能使体细胞转变为具有干细胞全能性质的细胞。许能使体细胞转变为具有干细胞全能性质的细胞。n经过研究发现可使用病毒载体将经过研究发现可使用病毒载体将Oct4，Sox2，c-Myc和和Klf4等转录因子导入到小等转录因子导入到小鼠皮肤成纤维细胞，形成具有干细胞形态鼠皮肤成纤维细胞，形成具有干细胞形态的细胞群落。这些细胞群落具有的细胞群落。这些细胞群落具有SSEA，也，也通过畸胎瘤形成等其他干细胞指标检测，通过畸胎瘤形成等其他干细胞指标检测，充分证明了它们具有多能性。充分证明了它们具有多能性。nOct4，Sox2被证明是维持干细

28、胞状态所必被证明是维持干细胞状态所必需的因子，而另外两个因子更多起到的是需的因子，而另外两个因子更多起到的是促进转化和抑制凋亡的作用。促进转化和抑制凋亡的作用。nOct4, Sox2, c-Myc 、 Klf4或或Oct4, Sox2, Nanog 、Lin28 Oct4 、Klf4或或c-Myc（神经细胞）（神经细胞） Oct4（鼠神经干细胞）（鼠神经干细胞）？n这一发现分别被这一发现分别被自然自然和和科学科学杂志评为杂志评为2007年年第一和第二大科学进展。第一和第二大科学进展。n2008.4，美国科学家将实验鼠皮肤细胞改造成，美国科学家将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，细胞，然后成功使其

29、分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。细胞。n2009.2，日本科学家宣布成功利用人类皮肤细胞制成的，日本科学家宣布成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且声称从技术上说用细胞培育出血小板，而且声称从技术上说用iPS细胞细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。培育人类红细胞和白细胞都是可能的。n2010.6，美、日的三个研究小组分别实现了将人体血，美、日的三个研究小组分别实现了将人体血细胞转化为细胞转化为iPS细胞。细胞。iPS细胞与胚胎干细胞相比有很多优点：细胞与胚胎干细胞相比有很多优点：niPS细胞则由体细胞诱导产生，不存在来

30、源的问题。细胞则由体细胞诱导产生，不存在来源的问题。niPS细胞取自病人组织，产生的是病人特异的干细胞，避免了免细胞取自病人组织，产生的是病人特异的干细胞，避免了免疫排斥反应。疫排斥反应。iPS细胞缺点：细胞缺点：nc-myc是原癌基因，此基因的失控会导致癌症的发生。是原癌基因，此基因的失控会导致癌症的发生。niPS小鼠存在明显的健康问题，死亡率很高。小鼠存在明显的健康问题，死亡率很高。n慢病毒载体的使用也会导致基因组的整合，诱发致癌危险。慢病毒载体的使用也会导致基因组的整合，诱发致癌危险。iPS在研究和应用上都面临着很多的挑战，解决这些问题将促进在研究和应用上都面临着很多的挑战，解决这些问题将促进iPS细细胞在临床治疗中的研究及应用。胞在临床治疗中的研究及应用。细胞衰老细胞衰老Cell senescence细胞衰老（细胞衰老（cell aging， cell senescence）n细胞衰老随时间推移，细胞增殖能力和生理功能下细胞衰老随时间推移，细胞增殖能力和生理功能下降的变化过程。降的变化过程。n形态明显变化，膜通透性脆性增加，细胞器功能下降，形态明显变化，膜通透性脆性增加，细胞器功能下降，遗传物质损伤增加等。遗传物质损伤增加等。n个体衰老建立在