北京培训中心_两虫全流程

1、1 水中隐孢子虫和贾第虫的检测爱德士培训中心Sep 27,20132流 程选 择回收率 3两虫检测全流程 样品预处理（Sample Pretreatment）. 染色镜检（Staining and Microscopy）. 免疫磁分离（IMS）. 过滤. 淘洗. 离心. 4样品预处理过滤加标实验（QC） 10L l 采样量5样品预处理过滤6样品预处理过滤l 滤芯结构过滤时水流流向淘洗时水流流向 79层多孔网状泡沫层，两种规格交互叠放，由790mm压缩至30mm，螺栓固定。 滤芯两个过滤层：外层区域为初滤器，内层滤核为选择性滤器（此结构在提高污水样品过滤速度的同时，保证有效地捕获隐孢子虫卵）。

2、淘洗时，目标微生物以反流的形式更方便地进行有效淘洗。 可处理高浊度原水。 取样流速可达4L/min。7样品预处理过滤l 实验室过滤8样品预处理过滤l 现场过滤9样品预处理过滤l 现场过滤两虫移动取样箱10样品预处理过滤 滤器 滤芯 采样管 水表 保温袋 自封袋l 现场过滤两虫移动取样箱11样品预处理过滤 根据客户需要合理设计的取样箱。 解决现场采样问题，并使得现场采样操作简便。 解决部分无两虫检测设备的送样问题。l 现场过滤两虫移动取样箱12样品预处理过滤l 现场过滤13样品预处理过滤l 现场过滤14样品预处理淘洗l Filta-Max Xpress两虫快速法淘洗设备 稳定的高回收率（大于70

3、%）。 淘洗时间90s，目前全球淘洗速度最快的设备。 一键操作，操作简单。 不同样品的结果一致性高，性能稳定。15样品预处理离心 离心机应放在牢固的工作台或地板上，尽量减少晃动。 离心管连同适配器一起配平，保证误差在0.5g以内，尽量减少摆动。 离心机设定2000g离心力，工作时间15分钟。 离心机应选用无刹车系统的（自然停止大约需7分钟） 。 16免疫磁分离 基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合，形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外磁场中，复合物被吸附而滞留在磁场中，使其与其他物质分离。 l 定义17免疫磁分离18免疫磁分离19免疫磁分离l 试剂盒20免疫磁分离样品量：0.5-

4、0.8ml沉淀混匀时间：1-2小时依次取下L型试管90旋转2分钟弃上清1XbufferA冲洗磁珠180旋转1分钟弃上清后酸化分离l 实验流程21免疫磁分离l 沉淀物体积对于沉淀量小于0.5mL的样品，直接再悬浮成10mL.对于沉淀量大于0.5mL的样品，按照上述公式，即每0.5mL沉淀悬浮成10mL。比如，2mL沉淀应该悬浮成40mL，具体免疫磁分离过程可以取其中一分部进行。根据经验，20L原水的沉淀量一般1-2mL；100L处理水的沉淀量一般小于0.5mL。22免疫磁分离l 结果计算如出厂水检测出3个隐孢子虫，带入共计进行计算： Y=（310mL)/(10mL100L)=0.03个/L如原水

5、沉淀量2mL，悬浮成40mL，免疫磁分离取了其中10mL，检出3个隐孢子虫，带入并计算： Y=（340mL)/(10mL20L)=0.6个/L23染色镜检l 染色试剂盒 单克隆荧光抗体染色试剂 复染液 封固剂 DAPI染色试剂 阳参 1倍洗脱缓冲液24染色镜检l 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为525530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质，例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物

6、活性物质的荧光标记。能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。储存条件：4避光保存。25染色镜检l 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm

7、，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。26染色镜检l 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)浓度2mg/mL，用时需要5000倍稀释，现用现配。27染色镜检l 镜检28染色镜检l 两虫孢囊与卵囊特征贾第虫孢囊 外形：卵形或椭圆形 直径：11-14um29染色镜检l 两虫孢囊与卵囊特征隐孢子虫卵囊 外形：类似球 直径：4-6um30染色镜检l 两虫孢囊与卵囊特征 苹果绿外壳：充要条件 大小和形状31染色镜检FI

8、TC染色DAPI染色DIC观察32染色镜检33染色镜检34染色镜检35如何提高回收率l 采用商售PBS淘洗液试剂品牌货号l PBSSigmaP4417-50TABl NaOHFluka38215-1EA-Rl HClFluka35335-1Ll Tween20SigmaP7949-100ML36如何提高回收率l 采用商售HCL和NaOH试剂，或标配所需酸碱37如何提高回收率l 对容器和管子进行润洗 使用0.05%的吐温20或者吐温80，对于样品接触的所有容器都进行润洗，将润洗的液体也加入样品。38如何提高回收率l 离心后，谨慎去除上清液 可采取虹吸，弃去上清。管子上插上枪头，使得震动最小。39

9、如何提高回收率l 谨慎清洗玻片 隐孢子虫和贾第虫可能在染色过程被冲走，为了避免此情况发生，请轻轻的移走玻片上的液体。40如何提高回收率l 玻片干燥过程可影响回收率 IMS过程中的酸如果没有有效中和可以破坏贾第虫的孢囊外表，引起贾第虫染色过程中的变化。这可以导致镜检过程中贾第虫的漏检。快速将样品干燥以及冷藏样品可以保证贾第虫的表面不受损坏 。 为了优化此步骤，确保样品一旦中和后，快速在37条件下干燥（最长干燥时间1小时），并立即染色。 如果IMS中和后需要延迟染色，需要快速在37干燥玻片后立即放入冰箱冷藏过夜。否则，需要在标准的家用冰箱冷藏过夜。在冷室中干燥玻片可能由于湿度环境使得玻片不易干燥。

10、41如何提高回收率l 免疫磁分离对于一些水样，很大一部分的隐孢子虫和贾第虫可能会遗漏在IMS磁珠上，在酸化过程中没有得到回收。此时进行二次酸化可以有效提高回收率。IMS分离过程中，二次酸化分离非常有用。对于回收率比较低没有满足回收率标准的样品，可以将其IMS过程废弃的上清液进行收集，对这些废液再次进行免疫磁分离过程，以满足回收率。可以将废液收集到免疫磁分离之前用的 50mL的离心管中，这可以避免错误的标记样品，你可以分辨哪个样品具有较低的回收率然后做一个二次的免疫磁分离。非常多的干扰免疫磁分离的物质在第一次免疫磁分离过程中都被去除掉了，所以第二轮免疫磁分离回收率可能会戏剧性的更高。42如何提高回收率l 可中断的