新城疫F蛋白基因工程疫苗的研究现状.docx

1、新城疫F蛋白基因工程疫苗的研究现状陶御，叶红2.(1.上海中信国健药业股份有阪公司.抗体筠物国家工程研究中心，上海201203；2.黄山学院生命与环境科学学院，安微黄山245021)摘要新城疫(Newcastledisease,NDV)是当今世界上最产虫的禽类传染病之一，被世界动物卫生iaiX(OIE)列为必须报告的传染痛。同预防其他伟染病一样，新城疫的主妾防控手段仍是免疫桂种。V妥白是构成新城疫<(NDV)致癌性的分子基础之一。妹述了国内外新城疚F妥白戚因工程戎苗的研究进展.关键词新城疫;F蛋白；基因工程我苗中图分类号S852.659.5Q789文献标识码A文童编号0517-6611(

2、2011)17-10468-02ResearchProgressesonGeneticallyEngineeringVaccineoftheNewcastleDiseaseVirusFusionProteinTAOJingetal(ShanghaiCPGuojianPharmaceuticalCo.,Ltd.,VaccineNationalEngineeringResearchCenter,Shanghai20(203)AbstractNewcastlediseaseisoneoflhemostseriouspoultrydiseases,especiallyinthefieldofpoult

3、ryraising.ItcouldbringgreateconomiclossanditwasdefinedasarankAinfectiousdiseasebytheOIE.NowthemainmethodtopreventNewcastlediseaseisstillthevaccineinoculation.NDVFproteinconstitutedoneofthemolecularbasesofpathogenicity.TheresearchprogressesongeneticallyengineeringvaccineoftheFproteinofNewcastlediseas

4、eviruswereexpounded.KeywordsNewcastledisease；Fprotein；Geneticallyengineeringvaccine新城疫病毒(Newcastaldiseasevirus,NDV)属副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)、腮腺炎病毒属(RubulaE),又称亚洲鸡痕病毒、禽副粘病毒I型(APMVJ)。该型可引起鸡、火鸡、鸵鸟、鸽子、孔雀及其他野鸟等多种成类发病，被国际兽疫局(theWorldOrganisationforAnimalHealthorOfficeInternationaldes

5、Epizooties,CHE)定为A类传染病,我国在进出口检疫中也把它定为一类传染病。NDV是单链负股RNA病毒，整个基因组全长15586个核背酸，分子地约为51-57KD。NDV编码6种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP)、磷徵白(Phosphateprotein,P)、基质贺白(Matrix,M)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、血凝素神经疑酸酶(HaemagglutininNeuraminidaseProtein,HN)和高分子量的RNA聚合醒(Largeprotein,L),其顺序为3，一NPPMFHNL5'。HN、F蛋白是构成

6、NDV致病性的分子基础。HN蛋白通过识别、吸附细胞表面受体从而启动病毒致病性.而F蛋白通过其融合多肽的穿膜作用产生致病作用。囊膜表面的M蛋白则通过抑制宿主细胞蛋白的合成.进一步协同HN、F蛋白产生致病作用。这3种强白中间F蛋白是构成NDV致病性的重要分子。F蛋白属I型糖蛋白。F蛋白基因编码一条由553个氨基酸组成的多肽,包括信号序列(SS)、位于覆基端附近疏水的跨膜结构域(TM)和一个由2530个氨基酸组成的细胞质结构域(CT)。F蛋白非活性的前体F0首先在蛋白胸的作用下裂解为F】和F2,这2个亚单位之间由二硫键连接，序列顺序为NH2-E2-FI-COOH。F蛋白有3个强疏水区，即裂解的N端信

7、号肽序列、C端膜固定点、F1裂解片段在N端的内部疏水区。其中.F2亚单位N端主要起信号肽的功能，翻译后被修饰剪切掉;F1亚单位的N端保守性很高，是引起融合作用的主要部位;F1亚单位的C端是疏水性跨膜区,是基金项目安横木击校自然科学研允项目(KJ20i0B2ll)o作者简介陶#(1973-),男，安澈芜湖人，工程师，从事生物制药的产业化研tE-mail:taojing<cpR)-0通讯作者，副教授，博士，从事伽奥与免疫学研E-mail：yehong2000312o收稿日期2011-03-24融合蛋白与病毒囊膜相结合的部位。F贺白能否被裂解由NDV毒株本身和宿主细胞二者的特性共同决定。强毒抹

8、的F蛋白能在多种宿主细胞内被裂解，从而对多种细胞产生感染力.最终导致全身感染;弱毒株的F蛋白只能在少数细胞中被裂解.临床上表现为局部感染。1重组抗原疫苗重组抗原疫苗是利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。首先将克隆获得的新城疫病毒保护性抗原基因引入原核或真核表达系统中，然后提取所获得的表达产品即可制成重组抗原疫苗。该疫苗具有安全性高、副作用少、稳定性好、易于批量生产等优点。Yang等在转基因鼠体内成功表达了NDVF基因，证明基因转染可以应用于亚单位疫苗对NDV进行预防。闻晓波等构建含有新城疫病毒的M、NP、F、HN4个基因的杆状病毒转移载体，获得了重组杆状病毒，经Westernbl

9、ot检测，在昆虫杆状病毒表达系统中同时共表达了新城疫病毒的M、NP、F、HN4个蛋白，为进一步研究新城疫病毒结构蛋白之间的相互作用以及重组抗原疫苗的研制等奠定了基础。重组抗原疫苗是新城疫疫苗未来发展的一个重要方向。2重组栽体疫苗重组载体疫苗是利用鸡痘病毒、火鸡疱疹病毒或某些细菌疫苗株作为载体,插入新城病毒F基因构建成的。该疫苗具有常规减毒疫苗和亚单位疫苗的优点,通过动物接种，在宿主体内大量表达所需的抗原,可成功诱导不同种类型的免疫应答，使接种动物得到免疫保护。鸡痘病毒的基因组不具有感染性,它在细胞中的复制是在病毒自身的酶及其独特的调控信号下进行的，它的转录、翻译和装配都发生在细胞质中,这与真核

10、细胞的尊因表达调控机理不同。目前此病毒已被广泛应用于重组病毒的制备,是研制禽病重组疫苗的首选载体。韦栋平等句构建了共表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒,PCR和Southernblot检测证实了F基因已插入鸡痘病毒的基因组;间接免疫荧光试捡表明，重组病毒能够正确表达F蛋白。智海东等用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV2gB2F）制备的多价疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒攻击.免疫保护率均可达到80%以上。3 DNA疫苗DNA是利用DNA重组技术将编码保护性抗原的基因克隆到真核表达载体,获得的重组体直接免疫机体，机体表达保护

11、性抗原经内源性抗原递呈途径递呈给免疫系统.诱发机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。与传统疫苗相比,DNA疫苗具有制备简单、成本低、稳定性好、免疫期长、免疫效果好、便于储藏和运输等诱优点。最早关于NDV基因免疫的报道是由Sakaguchi等提出的，他们从弱毒的新城疫病毒D26株克隆到F基因，插入到CMV和鸡0-actin（AG）启动子控制之后，对1周龄鸡肌肉注射,结果注射环状DNA的鸡没有明显抗体产生，但注射线性DNA的鸡有2/5产生抗体，线性和脂质体混合组有4/5产生抗体，抗体在接种后56周稳定，在疫苗接种9周后，用强毒攻击，产生NDV-F抗体的鸡得到保护。潘志明等R将新城疫病毒F融合蛋白

12、的基因克隆入真核表达载体.然后转化减毒鼠伤寒沙门薇，获得运送DNA疫苗的重组沙门菌，以2x108cfu/只的剂量2次免疫小检测到针对F蛋白的特异性血清抗体，表明运送DNA疫苗的减毒沙门菌系统在机体内能够成功释放所携带的质粒并能够刺激机体产生免疫应答。Loke等°：用新城疫F基因制备的DNA疫苗（pEGFP-F）能够产生高水平的抗体,对强毒攻击具有保护效果。王云峰等研发的鸡新城疫病毒F基因重组表达载体能够在真核细胞中高效表达,其表达效率比野生型F基因表达效率高，所表达的蛋白具有鸡新城疫病毒天然蛋白的免疫原性和生物学活性，并能刺激鸡体产生比野生型F基因DNA疫苗更加强烈的体液免疫应答和细

13、胞免疫应答,使免疫鸡获得100%的抵抗高致病力新城疫病毒株的致死性攻击，可有效阻止病毒在体内的增殖。近年来，在研究DNA疫苗上还考虑了同时连接细胞因子和具有免疫调节功能的调控因子等，使得DNA疫苗的临床保护率有所提高。4 F蛋白衰位疫苗随着对抗原分子一级结构和空间构象的深入研究，发现全蛋白基因中含有多种不同的抗原表位、调控序列、无关序列和免疫抑制序列。在基因疫苗的设计中，为了减少不同免疫优势抗原表位的互相干扰、无关抑制序列的负作用，人们将视线转至抗原表位。抗原表位作为诱生特异性免疫应答的结构和功能的最小单位,能够区分抗原的细微差别。如果选择优势抗原表位构建于合适的载体中，再辅助以必要的侧其序列

14、或免疫调控序列,免疫机体可以诱生针对所选抗原表位的特异性免疫应答。而且，如果将几个优势或特异性抗原表位串联结合在一起，还可以诱导机体产生针对不同毒株的抗体，获得最佳的保护效果。表位疫苗无需分离传染性病原体、不会散播病毒，通过选择最佳和最具免疫保护潜力的表位所构建的表位疫苗不仅可以诱生特异性免疫应答,而且免疫效果好，副作用少，同时多表位的联合、修饰或改造在质粒水平上操作方便。因此,表位疫苗不仅提供了一种更有效地利用病原体中抗原成分的方法,而且对于抗原变异日趋复杂的病毒来说是一种非常理想的高效疫苗。有关多表位基因疫苗的研究,国内外已有较多报道:Emmanuel等将淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV

15、）的T细胞表位嵌合入狂犬病毒G蛋白中，免疫小鼠后用致死剂量的LCMV进行攻毒，其保护率可达70%:Xiao等用串联的艾滋病毒（HIV）中和表位与载体蛋白偶联后，免疫小鼠、兔等可产生微弱的抗体应答和CTL反应。Gao'i等合成了一个源于丙型肝炎病毒JHCV）的多表位肽抗原微基因（CMEP），并克隆入GST表达靠体产生了融合蛋白GST-CMEP。将其与感染HCV病人血清作用发现其活力可达75%,与不同自然HVR1毒株的抗CEMP抗体的交叉活力可达90%。同时,构建的HCVDNA疫苗免疫兔后产生抗体.其交叉活力与GST-CMEP融合蛋白相当。Memamejadian等网构建融合乙肝的丙肝多表

16、位疫苗，采用DNA初免/肽加强剌激方案,产生了强烈的CTL反应和IFN分泌细胞,增强了n】反应。随着单克隆抗体技术的广泛应用,F蛋白的抗原位点逐渐被认识。Toyods等mi应用一组针对不同NDVF蛋白的单克隆抗体对抗原结构进行分析，认为F蛋白含有3个抗原决定簇，分别位于第72J6I和343位氨基酸残基位置。72位点（天门冬氛酸,Asp）位于F2亲水区,FI和F2之间的二硫键上的半胱氨酸残基有利于这一位点向F1的N末端接近,形成与抑制融合相关的抗原表位。】61位点（苏氨酸,Thr）位于F1的N末端.它所在区域的亲水性较低。343位点（亮氨酸,Leu）位于FI亚单位C末端高度保守的半胱基酸富集区，

17、在病毒的抗原性及结构和功能上起着重要的作用,是F蛋白主要抗原决定簇。Yu娅等”补研究发现F蛋白有5个中和性的抗原表位,Al：72aa,A2：78aa,A3：79aa,A4：157、16】、17O、171aa,A5：343aa,此外还有1个易变位点378aa。近年来.Collins等侦利用抗F蛋白的单克隆抗体可知NDV34/90株有7个抗原表位；而HitchnerBl株有5个交叉抗原表位。另外，随着生物信息学的发展，应用相关软件对其抗原表位进行综合分析,而且已证实某些毒株的预测抗原位点与已报道的基本一致,由此可见预测还是具有相当高的准确度义。将不同的NDV分离株F蛋白序列利用软件进行抗原表位分析

18、比较后，可得出其优势抗原表位。目前.NDV的F蛋白多表位疫苗的研制还需进一步深入口，相信会有广阔的应用前景。综上所述,随着分子生物学技术的不断发展，新城疫基因工程疫苗的研究取得了重大进展。相信在不久的将来，既能激发体液免疫又能激发细胞免疫的新型基因工程疫苗必将以其独特的优势在控制及消灭新城疫这一烈性传染病中发挥重要作用。参考文献1卡尔尼克BW.禽病学M.10版北京:中国农业出版社999：32-694.贺东生，秦智峰.刘福安.新瞰病毒系统发育分析及强屈毒株的撅U濒JL动物阪学进展,2000：27-31.PHTJJ,DASILVAE,GORMANJJ.Determinationofthedisul

19、fidebondamingrmcnl<rfNewcastlediseasevimshemagglutininneuraminidaseJJBioChon,2000,275（9）:M69-M78.4YANGZQ.IJUQQ,PANZM,etal.ExpressiondthefusionglycoproteinofNewcastlediseasevirusmtransgenicriceanditsimmunogenicitytnmiceJ.Vaccine,2007,25（4）:591-598.（下转第10482页）图3读写器天线模块Fig.3Reader'santennamodule

20、为250kbps,调制方式MSK,滤波带宽540kHz；测试条件:标签采用PCB天线，读写器依次采用PCB天线、外接EM天线、外接同轴天线、外接壁挂天线;其测试结果见表2。由表1、2可知，数据传输率等参数设置相同时,外接天线的通讯距离比PCB天线要远;3种外接天线比较而言，同轴天线和壁挂天线的通讯距离较远;500kbps数据传输率时通讯距离在28m范围内,250kbps数据传输率时通讯距离在40m范围内。从硬件成本角度考虑，壁挂天线价格远高于同轴天线，因此在相同通讯距离要求时,选用同轴天线更节约成本'七测试禽果Table1Theresultsofcomparisongroup1第比较组

21、第2比较组试验组数Experimentgroup读写器天线类型Readerantennatype丢包率PacketratioCRC校验错误率CRCcorrectmistakes/%RSSI强度RSSIintensitydBm通讯距离，mConununicationdistance丢包率Packetlgratio/%CRC校脸情误率CRCcorrect成就略,RSSI91度RSSIintensitydBm通讯距离Communicationdistance1PCB天线1.505.0-73.31120.752.0-73.38222外接EM天线0.754.0-69.68160.252.0-71.622

22、83外接同轴天线0.502.5-69.74280.251.5-70.98404外接壁挂天线0.252.0-73.13280.251.5-70.08404结语利用RFID技术实现畜产品养殖的安全管理,可快速、准确的追踪,使畜产品生产过程透明化，在食品链的源头有效控制动物疫病的发生、传播和扩散，保障畜产品的质量安全。在生猪养殖阶段采用该研究设计的有源电子标签和读写器，可提高猪肉产品的安全性,并对彻底实现食品的“源头”追踪和提供食品安全的透明化管理提供技术支撑。随着经济全球化.精细农业、精细养殖时代的到来，使用基于RFID技术的畜产品可追溯系统将加速产业改造并具有较好的社会效益,该系统的建设也会在实

23、际应用中不断探索并加以完善。参考文献1J赵金燕，南琳丽,高士争，等.生猪有源电子标签的设计和应用研究J.安徽农业科学,20»37(8)：3432-3434.赵金燕晦琳丽，高士争，等.基FRFID技术的动物食品可溯源系统研究J.云南农业大学报,砌,23(4)：528-531.刘学观，郭辉萍.微波技术与天线【M：.西安:西安电子科技大学出版社QINGX.YANG、.AFoldeddipoleantennaforRFIDJ).AntennasandPropagationSocietyInternationalSymposium,2(X)4(SI)：97-100.4 陈华君，林凡，郭东辉.等

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