流感疫苗的研究进展.docx

1、.综述DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.013流感疫苗的研究进展全病毒疫苗裂解疫苗病毒豚质体疫苗I血凝素f神经氛邮脂质基质蛋白II基质蚩白2核稽核策白复合体图1流感病毒灭活疫苗示意图作者单位：210009南京，中国弱科大学生命科学与技术学院通信作者：黄凤杰.Email：hQ；顾觉奋，EmailsyqyanI收稿日期：2015-03-10秦添，黄凤杰，顾觉奋流感病毒（influenzavirus）是正黏病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，系RNA病毒，直径80120nm,呈球形或丝状，其包膜上含有血凝素（HA）和神经氨酸醵（NA）

2、,从而形成了不同的亚型。人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、内（C）三型，是流行性感冒的病原体'4其特点是容易发生变异，其中甲型流感病毒最容易发生变异，可感染人和多种动物，为人类流感的主要病原，常引起大流行和中、小流行。例如，2009年甲型HIN1流感在全球范围内的大流行造成了至少1.2万人死亡。乙型流感病毒-般不会引起全球范围内的大流行，但是它能够引起地区性、季节性的流行。丙型流感病毒只会引起人类轻微的上呼吸道感染，极少造成流行。I前，预防人类流感致病和流行最有效的方法仍是接种疫苗。本文就近年来流感疫苗的研究进展作概述。1流感病毒灭活疫苗流感病毒灭活疫苗主要分为四类，包括全病毒灭活疫苗

3、、裂解疫苗、亚单位疫苗以及病毒原质体疫苗（图1）。1.1全病毒疫苗全病掘疫苗即完整的病毒粒子，其包含病毒全部抗原和脂质外壳。将流感病毒接种于鸡胚尿囊腔中，两天后收获尿囊液，加入福尔马林使其灭活，然后采用离心或色谱的方法对尿囊液进行进一步的浓缩和纯化，得到病毒原液，最后加入适当的佐剂即为流感全病毒灭活疫苗。灭活疫苗免疫原性高日.具有相对较低的生产成木，是目前最常用的方法。但这种方法对流感病毒进行分离或传代易引起其抗原性的改变，旦批量化生产时易造成污染。近年来，使用非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）代替鸡胚成为流感疫苗生产的发展趋势。Vero细胞已成功开发出了多种疫苗，研究表明，以低感染复数接种Ver

4、o细胞时，亦可获得高产底的流感病毒，且当细胞维持液中胰酸浓度为12.515ng/ml,pH为7.47.6时，可得到最大产粉。尽管如此，灭活疫苗仍存在许多缺陷，主要表现在：火活疫苗是一种死疫苗，失去了病毒的自然感染能力，皮卜接种只能刺激机体产生相应的IgG抗体，无法刺激呼吸道黏膜产生分泌型免疫球蛋白A（slgA）,故不能有效地阻止病毒在呼吸道内繁殖：由于流感病毒具有很高的变异性，故需要每年接种，这无疑增加了接种的痛苦和潜在的感染风险：其保护作用有限，交叉保护作用很弱；山于存在病毒膜脂质成分，只有较强的反应原性，在儿童中的发热率高.故不适用于12岁以下的儿童。1.2裂解疫苗裂解型流感病毒灭活疫苗是

5、采用合适的裂解剂和裂解条件将流感病毒裂解，去除核酸和大分子蛋白，只保留其抗原有效成分HA和NA以及部分基质蚩白（M蛋白）和核蛋白（NP）,然后进一步分离纯化制备而成。1.3亚单位疫苗亚单位疫苗是在裂解疫苗的基础上开发出的一种新型疫苗，其只包含病毒的HA和NA抗原蛋白，其他基质蛋白均被去除。这类疫苗大大降低了副反应的发生，安全性较高，但相应的，免疫原性也大大削弱，常不能引起有效的免疫应答。1.4病毒原质体疫苗流感病毒中的基质蛋白是由高度保守的敏基酸残基组成的膜蛋白，与HA和NA的易变性形成了鲜明对比。Berthoud等外设计制备出针对流感病毒A的核贫白和基质蛋白1（MVA-NP+M1）的新型疫苗

6、，并进行了I期临床试验。该疫苗具有良好的安全性和耐受性，诱导产生的T细胞数远高亍目前市售的任何一种流感疫苗。2流感病毒减毒活疫苗流感病毒减毒活疫苗（LA1V）是将病杰在人工培育的条件下，使其致病性大部分丧失，但仍保御其免疫原性，故仍可刺激机体免疫细胞产生抗体的一类疫苗。其和自然感染具有很大的相似性，克服了灭活疫苗对儿童和老人免疫原性低的不足，所以其诱导的免疫反应相比灭活疫苗更加迅速和强烈。与灭活疫苗相比，优势主要表现在：能有效地控制流感病毒在呼吸道的繁殖：可滴鼻或喷鼻途径给药：对不同亚型的流感病毒具有一定的交叉保护作用。LAIV-般为经鼻接种的三价季节性疫苗，包括两种A型（H】N1和H3N2亚

7、型）和一种B型流感病毒叫LAIV在婴幼儿、儿童和成人中均具有息好的耐受性。LAIV相对于三价灭活流感疫苗（TIV）显示出了更好的免疫效果，在许多国家659个月的婴幼儿和儿童中已进入了III期临床试验。而在成人中，这种优势却不明显，故欧洲健康署还未批准其应用于成人。目前，应用比较广泛的LAIV为冷适应性疫苗，通常由基因重组的方法获得。Kiseleva等研究表明，重组病毒并不会其有更强的毒力或产生更强的损伤作用，这为LA1V的安全应用提供了额外的依据。此外，一些单价LAIV可对多种病毒亚型起作用，如有研究表明，H7N3减毒流感疫苗亦可预防H7N9筒流感病毒的感染同。3基因工程疫苗流感病毒基因工程疫

8、苗即使用DNA重组技术，将天然或人工合成的病毒遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，再经纯化而制得的疫苗。由于病毒主要的免疫学结构为HA,其含有大多数的抗原决定簇，所以采用基因工程的方法直接合成HA为制备流感疫苗提供了新思路。长期以来，人们认为流感疫苗生产中血凝素分子必须在脊椎动物细胞中表达，以实现蛋白质分子的折叠、糖基化和分泌。但随若研究的深入，这种说法已经不是很准确。美国疾控中心的一个实验室通过敲除HA的N端糖基化位点制得的DNA疫苗，将其免疫小鼠，结果发现其免疫原性并没有明显的变化凶。随后，另外两个团队在Escherichiacoli中也成功表达出了流感病毒HA网。

9、美国策白质科学公司通过昆虫细胞病毒载体（杆状病港群）感染昆虫（粘虫、草地贪夜蛾）细胞，成功制得了流感血凝素FluBlok,使用昆虫细胞表达外源基因越来越得到了人们的认可。种上市的人类乳头痛融合蛋白病毒疫苗CervarixR即是使用的这种表达系统。FluBlok是一种新型的蛋白疫苗，其包含三种全长的重组HA蛋白，即甲型HIN1流感病隹HA、甲型H3N2流感病毒HA和乙型流感病毒HAoFluBlok是首个采用DNA重组技术生产的三价流感疫苗，相比丁传统的鸡胚生产模式，其具有可大鼠制备、纯度高等特性。临床试验显示这种疫苗具有良好的酎受性和免疫原性。2013年I月16日，美国FDA批准FluBlok上

10、市，用于预防1849岁人群的季节性流感也美国Novavax公司采取与FluBlok相似的方法，通过杆状病毒载体感染昆虫细胞得到了一种病毒样微粒（virus-likeparticles,VLPs）。该微粒含有HA、NA和流感病毒基质蛋白。基质蛋白可使HA和NA牢固地结合在其上，从而构成一个VLPs。这种微粒的优点在于能够利用树突状细胞微粒识别机制来摄取该粒子。美国弗劳恩霍夫分子生物技术中心使用烟草花叶病毒裁体在烟叶中表达出了HAo将植株反向放置在容器中，然后向其中缓慢加入载体病毒DNA溶液，直到淹没叶片为止。在其空的环境下，叶片底部的气孔打开，将DNA吸入其中，从而得到表达。这种疫苗在】期临床试

11、验中显示出了免疫原性"七加拿大Medicago公司使用农杆副乍为载体也取得了成功"I4核酸疫苗4.1DNA疫苗DNA疫苗即把-个或多个编码抗原蛋白的基因克隆到真核表达载体上，再将此重组载体导入机体内，从而表达得到抗原蛋白，激活机体的免疫反应。相对于普通疫苗，DNA疫苗有以下优点：质粒DNA稳定性较高；生产工艺简单，成本低：相对于减毒活疫苗，不具有感染的风险：一个质粒DNA可编码多种抗原蛋白；可诱导体液免疫和细胞免疫双重反应（同。目前，DNA疫苗的主要给药方式仍是肌肉注射，这使得疫苗很难穿过细胞膜，仅有少量到达抗原呈递细胞（APC）而引起免疫反应，这无疑限制了DNA疫苗的应用

12、。Zhao等I岫使用乳化分散法，将猪流感病毒DNA疫苗封装于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球中，测定了权免疫应答强律，结果显示，微球其有较高的封装率和稳定性，表达出的抗原蛋白具有良好的生物活性且表达持续时间长，明显提高了DNA疫苗的免疫效率。随后,其使用笈合凝聚法将猪流感病毒DNA疫苗封装于壳聚糖纳米粒子中，亦取得了良好的效果"七4.2mRNA疫苗mRNA疫苗作用机制与DNA疫苗相似，mRNA疫苗经接种后，不需要转运到细胞核中而可以直接被翻译，从而延长了其半衰期。相比于DNA疫苗，mRNA疫苗具有更高的抗原蛋白表达量，给药量:可以得到更精确的控制，且可以降低整合到宿主基因组的风

13、险。Petsch等（科通过优化mRNA疫苗的GC含最和UTR序列，再将其整合到核酸精蛋白上，从而使mRNA免受RNase的降解，提高了其稳定性。有研究表明，流感mRNA疫萌对流感病毒感染的小鼠、雪貂和猪模型均具有良好的免疫效果蛋白目标位点恍点的功能可能的保护机制HAHA高度保区融合活性抑制HA的成熟和病毒的释放；抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）M2M2外功能区（M2c）离f通道ADCC：抗体依赖的NK细胞活性；补体介导的细胞溶解作用NPT细胞和抗体表位T细胞激活和非中和抗体CD8*细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的细胞溶解作用：B淋巴细胞的激活以及CD4'T淋巴细胞介导的细胞溶解作用M

14、lT细胞表位T细胞激活CD8*细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介牙的细胞溶解作用：B淋巴细胞的激活以及CD4*T淋巴细胞介导的细胞溶解作用NA保守的唾液酸沔活化位点哽液酸情抑制病毒的扩散蛋白目标位点恍点的功能可能的保护机制HAHA高度保区融合活性抑制HA的成熟和病毒的释放；抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）M2M2外功能区（M2c）离f通道ADCC：抗体依赖的NK细胞活性；补体介导的细胞溶解作用NPT细胞和抗体表位T细胞激活和非中和抗体CD8*细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的细胞溶解作用：B淋巴细胞的激活以及CD4'T淋巴细胞介导的细胞溶解作用MlT细胞表位T细胞激活CD8*细胞毒性T淋巴

15、细胞（CTL）介牙的细胞溶解作用：B淋巴细胞的激活以及CD4*T淋巴细胞介导的细胞溶解作用NA保守的唾液酸沔活化位点哽液酸情抑制病毒的扩散表1通用流感疫苗的病毒靶点5通用流感疫苗通用流感疫苗所采用的抗原世白通常有HA、M（Ml和M2）、NP和NA蛋白。各种抗原的靶向位点、靶向功能和可能的保护机制如表1所示。目前，研究最多的是基于M2、NP和Ml的通用流感疫苗。5.1基于M2的通用流感疫苗M2（M2e）是一种小膜本体蛋白质，起到pH依赖的质子通道作用，在HA的成熟加工和病毒基因缉释放到细胞质的过程中必不可少然而，基于M2蛋白的疫苗免疫原性较弱，因此人们采用了许多方法以克服此缺点，如将M2肽段整合

16、到免疫原性强的载体蛋白上，或通过杆状病毒或哺乳动物细胞表达的蛋白质而得的VLPs进行递送”8）。5.2基于NP和M1蛋白的通用流感疫苗甲型流感病毒中NP和MI蛋白的基基酸序列相对保守，因为这些蛋白未暴露在病毒表面，主要引起细胞免疫应答，尤其是CTL应答【叫在小鼠中，除了CD8*CTLs外，NP抗体还参与了基于ADCC的病毒清除作用【2。】。然而，在人体中，抗NP抗体水平变化多样且很少通过三价灭活疫苗而增加，因此，NPAb介导的ADCC在人体异源亚型免疫中的保护作用尚不明朗】。目前，人们采用基于载体或基于宜链肽段的抗原递送方法来诱发入体有效的CTL应答。临床】期和II期试验使用改良的安卡拉疫苗病

17、毒（MVA）表达NP和Ml蛋白，结果表明，尽管过高剂岚仍会引起-些不适，如恶心、呕吐等反应，但总体上MVA-NP+M1疫苗安全性较高。另有研究使用从甲型和乙型流感病毒中分离出的多种病毒蛋白（HA、NP、Ml）,制成含有多种线性表位的重组蛋白，这种疫苗即使在高剂量卜亦具有良好的耐受性，其产生的抗体可诱导ADCC作用，具体机制尚不清楚12气6流感疫苗佐剂佐剂是一种非特异性免疫增强剂，与抗原共同使用时可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。6.1铝胶佐剂铝胶佐剂是目前使用最广泛旦历史最悠久的流感疫苗佐剂，主要有氧化铝、氢氧化铝和磷酸铝三种形式。其中组氧化铝具有安全性较好、不良反应少等特点，最为

18、常用。Thueng-in等采用鳞酸铝佐剂制作了毒株NIBRG-I4的全病毒灭活疫苗，用来预防甲型H5N1流感，试验表明安全性较好且只需接种一剂即可产生免疫。随若纳米科技的发展，纳米ai（oh）3佐剂慢慢引起了人们的关注，其具有粒径小、比表面积大等特点，在增强佐剂活性的同时，又大大降低了副作用，不失为一个耕新而有前景的研究方向。6.2表面活性剂MF59是一种水包油乳剂，瑞士诺华公司己将其应用于T1V中，其疫苗的净剂缺未增加，但免疫原性得到了大大提高。AS03也是一种水包油型乳剂，英国葛兰素史克公司将其用于H1N1流感疫苗Pandemrix中GLA-SE是一种稳定的水包油型纳米乳，作为Toll样受

19、体（TLR）激动剂，法国赛诺菲巴斯德将其用在Fluzone*中，实纶表明它可以有效增强机体的保护性免疫【2也流感病毒灭活疫苗即使不加铝胶佐剂亦具有效力。在许多TLR7敲除的小鼠中，流感病毒灭活疫苗具有更高的效力，表明这种现象依赖于TLR7的信号转导31。流感病毒灭活疫苗中残留的病毒RNA可通过TLR7信号转导起到佐剂的作用。然而，此作用对于其他单链RNA病毒仍有很大争议，因为TLR7和TLR8的多态性并不能影响麻疹死疫苗的免疫应答"I。7小结与展望流感病毒是目前研究得最透彻的病毒之一，但因其具有极强的变异性，尤其是甲型流感病毒，给科研和治疗带来了极大的困难，至今仍没有创造出可完全杜绝

20、流感发生和流行的疫苗或方法。近年来流感疫苗的研究飞速发展，一些新型疫苗技术也在流感疫苗的生产中得到了成功应用。新的疫苗给药方式如微粒介导透皮输送（PMED）系统等也显示出了广阔的应用前景，各种优化的疫苗组合方式，如佐剂在通用疫苗和DNA疫苗中的联合应用，成为了未来研究的主要趋势。理想的流感疫苗应该具有较大的温度适用范围，剂型简单便于管理，单一剂鼠能保护多种亚型的流感和能够起长期保护作用等特性。在新的形势下我们需加快流感疫苗及相关技术的研发，以应对未来更加复杂的流感疫怙。参考文献AmorijJP,HuckriedeA,WilschutJ,etal.Developmentofstableinflu

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