牛病毒性腹泻病二价弱毒活疫苗制备工艺研究.docx

1、特产研究SpecialWildEconomicAnimalandPlantResearch1文章编号：1001-4721(2013)01-0001-03牛病毒性腹泻病二价弱毒活疫苗制备工艺研究李海涛，苗利光，刘艳环，朱言柱，安亚雄，王坤，冯卓(中国农业科学院特产研究所，长春130112)摘要:研究了BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3二价弱毒活疫苗的制备工艺。通过对BVDV2/JZQ5-1和BVDV1/JZ05-3疫苗毒传代培养测定毒价后,试制出5批毒价分别是lOTCHVmL和ITCIIWmL的BVDV二价弱毒活疫苗，经检验符合试验设计要求。关键词:牛病毒性腹泻;病毒;活疫苗中图

2、分类号：1M64文献标识码:AStudyonPreparationTechniqueofDivalentAttenuatedVirusLiveVaccineofBovineViralDiarrheaVirusLIHai-tao,MIAOLi一guang,LIUYan-huan,ZHUYan-zhu,ANYa-xiong,WANGKun,FENGZhuo(InstituteofSpecialWildEconomicAnimalsandPlants,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changchun130112,China)Abstract:Theaimo

3、fthisstudywastoexplorethepreparationtechniqueofdivalentattenuatedviruslivevaccineofbovineviraldiarrheavirus2/JZ05-1(BVDV2/JZO51)andBVDV1/JZ05-3.BVDV2/JZ05-1andBVDV1/JZ05-3werecontinuouslycultivatedinceUculture.Thepoisontitorwasexamined.5groupsofdivalentattenuatedBVDVlivevaccinewereproduced.Tliepoiso

4、npriceswere105TQDjo/mLandKr'TCIDjo/mlorespectively.Thevaccineswereexaminedandwaswithintherangeofthetestdesignrequirement.Keywords：bovineviraldiarrhea;virus;livevaccine牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)为黄病毒科瘟病毒属的代表种，主要宿主为牛、羊、猪和鹿等。目前该BVDV在世界范围内广泛分布。感染BVDV的临床症状主要有发热、腹泻、黏膜溃疡、持续性感染、白细胞减少、免疫抑制和生殖

5、障碍等。本研究利用已分离鉴定的BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3疫苗株，根据疫苗毒的生化特性、繁殖培养条件，选用MDBK细胞系繁殖高毒价病毒液,试制出5批二价弱毒活疫苗，经过相关检验,结果符合疫苗生产要求。1材料和方法1.1材料1.1.1 毒种和细胞BVDV2/JZ05-1.BVDV1/JZ05-3疫苗毒株(-70勾保存,TCIDso不低于伸，由中国农业科学院特产研究所苗利光博士保存)；MDBK细胞(中国兽医药品监察所菌种保藏中心)。1.1.2 试剂MEM(FisherScientific公司)；标准胎牛血清(天津源样生物制品有限公司);其它试剂均为进口或国产分析纯。收稿日期：

6、2013-01-16基金项目：吉林省科技发展计划(20100219)作者简介:李海涛(1981-),男,河北省邯郸人，硕士，从事动物病原生物学和分子免疫学研究。*通讯作者:苗利光,E-mail：mliguang66.1.2方法MDBK细胞传代培养将冻存在液氮罐内的MDBK细胞取出，迅速在37T水浴中复苏，然后转入无菌室进行细胞传代。复苏的MDBK细胞接种至含有10%标准胎牛血清、30昭/也庆大霉素的MEM培养基中，37Y、5%CO2培养。培养23d至单层细胞时进行连续传代,至适宜代次后,可进行病毒接种传代操作。1.2.1 疫苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3的制备将保存的疫

7、苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZO5-3,种毒稀释后以0.01-0.001MOI接种单层MDBK细胞，加入含有2%标准胎牛血清、30Mg/mL庆大霉素的MEM维持液中，转入37幻、5%C%培养。当出现80%-90%细胞病变时，-20Y反复冻融3次，收获病毒液同时取样测定毒价。然后将病毒液冻存于-20T：oBVDV二价活疫苗试制根据BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3病毒液的毒价和最小免疫剂量,用维持液稀释病毒液至疫苗制备所需毒价，分装后-20Y冷冻保存。1.2.2 BVDV二价活疫苗检验按照生物制品检验规程对试制的BVDV二价活疫苗的物理性状、无菌和支原体检验、安全

8、检验、免疫原性检测进行检验。2结果2.1 MDBK细胞传代培养MDBK细胞接种至含有10%标准胎牛血清、30妃也庆大霉素的MEM培养基中，37Y、5%CO2培养23d时可形成单层细胞,显微镜检观察细胞形态为梭形，细胞界限明显。2.2 疫苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3的制备疫苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3的最佳制备条件是种毒稀释后以0.01-0.001MOI接种单层MDBK细胞，加入含有2%标准胎牛血清、3（WmL庆大霉素的MEM维持液中，转入37T、5%COz培养。35d出现80%90%细胞病变，-20幻反复冻融3次，取样测定毒价。疫苗毒BVDV

9、2/JZO5-1和BVDV1/JZ05-3的毒价分别是1078TdD5o/mL和1076TCIDjo/niLoBVDV二价活疫苗试制制备的BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3病毒原液分别用细胞维持液稀释至1054TCID5o/mL和1056TCID5o/mL,分装后-20T冷冻保存。2.3 BVDV二价活疫苗的检验经检验，试制的5个批次的疫苗物理性状正常，无菌和支原体检验均未检出，安全检验结果安全，免疫28d平均血清中和抗体滴度lofeSNso均在7.0以上。检验结果显示试制的5个批次的BVDV二价弱毒活疫苗均能达到试验设计要求，结果见表lo表1BVDV二价活疫苗检验结果Tabl

10、e1TheresultsofliveBVDVvaccine疫苗Vaccine批次lx)tno.物理性状Physicalcharacter无菌和支原体检验Sterileandmycoplasmatest安全检验Safetytest免疫28d平均血清中和抗体滴度(loftSN«)Neutralizingantibodytiterinsenunafter28daysofimmunizationBVDV2/JZD5-1+BVDV1/JZ05-3SCII-1正常Normal合格Qualified安全Safety7.87.3BVDV2/JZO5-1+BVDV1/JZ05-3sen-2正常Norm

11、al合格Qualified安全Safely7.37.3BVDV2/JZO5-1+BVDV1/JZ05-3sell-3正常Normal合格Qualified安全Safety7.87.8BVDV2/JZO5-1+BVDVI/JZO5-3sen-4正常NormaJ合格Qualified安全Safety8.08.3BVDV2/JZO5-1+BVDV1/JZ05-3SCll-5正常Normal合格QualiGed安全Safety7.38.0（下转第18页）18处理均表现为催根期生根条数多、根鲜重高、出圃苗木根系多、苗蔓成熟度高、苗木质量优于其它试验处理。通过试验筛选出了“雪兰红”硬枝抨插适宜的生根剂：票

12、乙酸150mg/kg或n引噪酸150mg/kg,浸泡插条基部5cm处6h。可在生产中应用。3.2试验中观察到，“雪兰红”芽眼萌发的生物学温度低，在5Y以上时芽眼即可萌发，在塑料大棚或温室内进行硬枝抖插育苗，催根期间棚内气温很难控制，气温过高会导致插条芽眼先萌发、展叶抽梢未生根、耗尽插条内的贮藏营养后死亡。因此，“雪兰红”硬枝扑插育苗必须在育苗的头1年的秋季在室外修筑回龙火炕或电热温床(电热温床用电量大，费用大幅度高于回龙火炕)。3.3“雪兰红”硬枝抨插育苗技术复杂，每个技术环节的操作要认真细致，例如插条和生根剂的质量、催根火炕是否好烧、炕床温度是否均衡、温湿度控制、苗圃地管理等，否则会导致育苗

13、失败。参考文献1 宋润刚.中国山葡萄产业发展及对策J.中外葡萄与菊萄酒,2009,(3):33-35.2 宋润刚，路文鹏，张庆等.酿酒葡萄新品种'雪兰红'J.园艺学报,2012,39(11):2312-2314.3 范书田.杨义明,刘景宽，等.生根粉和荼乙酸对左优红硬枝扑插生根的效果J.特产研究,2008,(2):42-43.4宋润刚，路文鹏,沈育杰，等.山葡萄品种硬枝抨插生根研究J.中国果树,2001,(】)：47.5宋润刚，张庆田,刘景宽，等.不同种类生根剂对葡萄品种“北冰红”硬枝抒插生根成苗效果的研究J.北方园艺,2009,(11):86-89.(上接第2页)3讨论BVD

14、V疫苗自出现以来，被USDA认证用于商业化生产的已超过160种，这些疫苗有BVDV单价苗，也有BVDV与BHV-1、PI-3、IBR和Pasturella的联苗。BVDV疫苗的制剂类型主要有灭活疫苗、改良活疫苗(Modifiedlivevaccine,MLV)和基因工程疫苗。BVDV-1型和BVDV-2型的混合疫苗国外的很多公司已有商业化的产品。Dean和Leyh在1999年通过对BVDV-1型WRL株改良活疫苗对BVDV-2型毒株的交叉免疫和交叉保护的研究发现，在一定程度上能使牛产生BVDV-1型和BVDV-2型抗体，并维持相对较长的时间。Ridpath也在2005年做了类似的研究，但是抗体

15、的中和滴度差别较大。本研究利用已分离保存的BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3疫苗毒株，进行合理配比制备出BVDV二价弱毒活疫苗。对试制的5个批次的疫苗进行了物理性状、无菌和支原体检验、安全检验和免疫28d平均血清中和抗体滴度方面检验，结果显示物理性状正常，未检出细菌和支原体,安全检验结果安全，免疫28d平均血清中和抗体滴度lofeSNjo均在7.0以上。检验结果显示试制的5个批次的BVDV二价弱毒活疫苗均能达到试验设计要求。为工业化生产BVDV二价弱毒活疫苗奠定了基础。参考文献1JReichelMP,HillH,VogesH.DoesControlofBovineVviralD

16、iarrhoeaInfectionMakeEconomicSsense?J.NewZealandVetJ,2008,56(2):60-66.201afsonP,MacCallumAD,FoxFH.AnApparentlyNewTransmissibleDiseaseofCattleJ.CornellVet,1946,36:205-213.3】牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验J.特产研究,2012,(4):8-9.4 牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1基础毒株的安全性和免疫原性研究J.特产研究,2012,：5-8.5 IizzagoC,BandiC,BronzoV,etal.DistributionPatternofBovineViralDiarrheaVimsStrainsinIntensiveCattleHerdsinItalyJ.VetMicrobiolgy,2001,83:265-274.6RidpathJF.PracticalSignificanceofHete