犬瘟热病毒DNA疫苗接种犬的免疫保护.docx

1、犬瘟热病毒DNA疫苗接种犬的免疫保护徐向明'，殷俊'，杨玲'，李娜'，薛整风'，崔治中2(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009;2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018)摘要:用犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白基因(H、F)和核蛋白基因(N)重组质粒DNA和聚乙烯胺(PEI)混合后肌注10只3月龄CDV抗体阴性毕格犬.间隔30d，共免疫3次，另选择5只犬作为阴性对照。免疫3次后.采用CDV攻毒。对照组呈现出犬瘟热的典型症状和组织病理损害，攻毒3周内，有2只犬衰竭死亡.1只犬症状明显.攻毒第18天外周血淋巳细胞中病毒RNA检测为阳性。DNA疫

2、苗免疫组除出现一过性的体温升高外，未出现明显症状，攻毒后第18天外周血淋巴细胞CDV检测仍为阴性。DNA疫苗免疫后血清ELISA抗体和病毒中和抗体测定显示，首免后机体激发的ELISA抗体滴度很低(IO】25=。郎)，二免后开始缓慢升高(10商R2甜),再次免疫后达到10顷=。.川；中和抗体也呈现以上规律，三免后血清中和抗体为IO,75±ftl9°,攻毒后血清ELISA抗体和中和抗体滴度迅速升高(IO，"士。*和I""±o.g)。试淌表明CDV基因免疫对CDV的感染具有较好的保护作用，并能清除进入机体内的病毒。CDV基因免疫只激发较低水

3、平的体液免疫.中和抗体在攻毒前达不到临界保护线(10,),但对CDV攻击能产生较好的保护，推测其免疫效力可能源于细胞免疫和记忆性B淋巴细胞。关键词:犬瘟热病毒;DNA疫苗;抗体;免疫保护中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:100524545(2008)0921011204ImmuneprotectionindogsinoculatedbyCDVDNAvaccineXUXiang2ming*,YINJun*,YANGLing*,LINa*,XUEZheng2feng*,CUIZhi2zhong2(1.CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUnive

4、rsity,Yaugzhou,Jiangsu225009,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgriculturalUniversity,Taian,Shandong271018,China)Abstract:Thethreeplasmid(pCDNA2H,pCDNA2FandpCDNA2N)mixedwithPElwereinjectedintothemus2cleofCDVantibodynegativeBeagledogsthatare3monthsold,other5dogsweretreatedasnegative

5、control.Afterthreetimesofimmunization,dogswerechallengedwithtissuehomogenateofCDV.Thecontroldogsappearedtypi2calsymptomsandpathologiclesions.After3weeksofchallenge,2dogsdiedofprostration,oneoccurredevidentsymptom,andvirusRNAinitsperipherallymphocyteispresent.Theimmunizedgroupofdogsdidnotappearevi2de

6、ntsymptomexceptthutbodytemperatureeievatedtransiently,andCDVofperipherallymphocyteisahsentafter18daysofchallenge.ELISAtiterwasverylow(I0125a6l>)afterthefirstimmunization,anditboostcdslowly(101粉±a胡5)afterthesecondimmunization.thenreach10-051±0-214afterathirdimmunization.Theneutralizingan

7、ti2bodylitervariedwiththesamelaw,andwas10'7510,90afterlhethirdimmunization.ELISAtiterandneutralizingantibodyliterboostedquickly(1O'02'l加andIO241ft245).TheseexperimentsindicatcthatDNAvaccinecanprotectdogfromCDVinfectionandeliminatethevirusinbody.Althoughthevaccinestiinulatedlowlevelofhumo

8、ralitnnui2nity,andtheneutralizingantibodydidn'treachthecriticallevel(10'、).thevaccinationpmtecteddogefficiently.ItispresumedthattheimmuneeffectmightbeprovidedmainlybycellularimmunityandniemoryBlymphocyte.Keywords:caninedistempervirus:DNAvaccine:antibody;immuneprotection自20世纪90年代初期，首次报道用质粒DNA

9、作为疫苗,从而掀起了疫苗的第3次革命。其与传统疫苗相比存在着许多优点，首当其中就是它的安全性，目前还未报道质粒DNA与宿主染色体的整收稿日期:2(X)6211230基金项目：江苏省科技基础条件建设资助项目(BM200301)：江苏省教育厅自然科学基金资助项U(VK4IOO82)作者简介:徐向明(19692),男.副教授.博士。合现象，且质粒可在非动物源性环境下大量生产，并可高度纯化。此外，机体可合成与病毒感染期内结构相同的抗原，诱导机体产生强烈的细胞免疫。DNA疫苗也存在着一些亟待解决的问题，如激发的体液免疫不强“习，质粒DNA进入机体易被降解而造成APC摄取量降低等，因此，许多学者尝试用不同

10、方法提高DNA疫苗的保持力，包括目的基因与细胞因子共表达”I将重组质粒直接导入免疫系统的特定细胞z；用磷酸铝或脂质体及阳离子类脂包装质粒犬瘟热的预防控制一直是研究的焦点，除了全球普遍使用的活疫苗外，近年来对犬瘟热病毒(CDV)的重组活载体疫苗和DNA疫苗的研究也取得了长足的进展，而国内未见报道。徐向明等们将CDV中国分离株(CDV2YZ0101)的囊膜糖蛋白F和H基因插入pcDNA*J2)中，在COS27细胞验证其表达后，免疫BALB/c小鼠能激发机体的免疫应答。为了进步探讨DNA免疫在自然宿主体内的免疫应答,本试验将以上2个表达质粒及本室构建的CDV核蛋白基因(N)的重组质粒(pcDNA2N

11、)与聚乙烯胺(PEI)混合后免疫CDV抗体阴性犬，检测其诱导的血清ELISA抗体和病毒中和抗体，并采用CDV感染犬的组织匀浆攻毒后观察其保护力。1材料与方法1.1质粒与菌种pcDNA2H、pCDNA2F和pcD2NA2N重组质粒的构建参照文献6进行；宿主菌D由本室保存。1.2重组质粒DNA的大量制备与纯化pcDNA2H、pcDNA2F和pcDNA2N重组质粒的抽提按QIA2gen公司的PlasmidMegaKit说明书方法进行，质粒DNA定量后用5%无菌葡领糖注射液稀释至015g/L,-20°C冻存备用。PEI溶液配制后-20°C保存，使用时与DNA的比例为DNA:PEI=

12、100Pg:100ULoI.3试验动物Beagle犬(普通级)由扬州大学比较医学中心提供。1.4动物分组及处理3月龄的Beagle犬于试验前采血分离血清，选择CDV抗体检测阴性的15只犬。将其随机分成2组，其中重组质粒DNA免疫组10只，每只犬注射pcDNA2H、pCDNA2F和pcD2NA2N3种质粒各200Ug与600uLPEI溶液的混合液，两后肢分点肌注，以1个月为间隔，共免疫3次，同时设5%灭菌葡萄糖注射液肌注为阴性对照组，于每次免疫前、攻毒前、攻毒后2周肢静脉采血，分离血清，-20°C保存待测。1.5血清中ELISA抗体及病毒中和抗体的检测ELISA抗体采用北京世纪元亨动物

13、防疫技术有限公司的CDV抗体ELISA试剂盒进行，病毒中和抗体的检测采用固定病毒稀释血清法进行。I. 6攻毒保护试验毒株CDVYZ0201(TCID*为IO"/。.1mL)由本室分离鉴定，将该毒株第5代Verc细胞培养物按lO'TCID、。接种2月龄未免疫的Beagle犬，取有典型犬瘟热症状并死亡犬的脑、月干、肺、淋巴结和脾脏的组织匀浆作攻毒用。试验犬于最后一次免疫后28d,用上述组织匀浆进行攻毒，采用点眼、滴鼻和腹腔注射3种方式混合接种，逐H测量体温，观察临床体征,攻毒后3周，所有犬均扑杀，取各主要脏器,10%福尔马林固定，石蜡切片,HE染色后进行常规病理组织学观察。1.7

14、外周血中病毒RNA检测1.7.1外周血淋巴细胞的准备在攻毒后第18天(对照组2只死亡犬于第15天)采取抗凝血。在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入抗凝血，2000r/min离心20min后，吸出中间乳白色的细胞层，离心后加入适量的PBS溶解，-20C冻存。1.7.2RT2PCR参照GenBank已发表的CDV核衣壳蛋白(N)基因序列，设计1对引物(括号中的数字代表在全基因组中位置)：PI:5'2GCAGAATC2CGACCTATCTTTGAGGC23'(783798nt),P2:5/2CGAGTCGACGACTGGTCTTGAATA23,(1655I679nt)。模板RNA

15、抽提及RT2PCR参照文献7进行。2结果2.I重组质粒免疫后ELISA抗体检测结果3种质粒DNA和PEI混合后肌注试验犬，于每次接种前均采血分离血清，攻毒前及攻毒后也同样采血分离血清ELISA检测血清中抗CDV抗体，所有试验犬在试验前ELISA抗体均为阴性，第1次肌注质粒后，只激发了微弱的抗体水平(io*，士。颂)，二免后检测出10,69±0285滴度的ELISA抗体，攻毒前抗体水平有所提高，达到io205±0-2,4,K性对照组在此过程中均未检测出明显的抗体水平。攻毒后试验组抗体水平迅速升高,达到了10"E*,而对照组也检测出iow±w的elISA抗体

16、，但不如免疫组高。2.2重:组质粒免疫后病毒中和抗体的动态变化CDV囊膜糖蛋白和核蛋白基因首免后，只检测出微弱的中和抗体10°*±°曷，二免后能检测出10'202也加的中和抗体，再次免疫后中和抗体滴度有所升高，达到iomqm,攻毒后中和抗体迅速升高可达到左右，而阴性对照组在此期间除2只犬攻毒后检测出低于1：8的中和抗体外，其余中和抗体均为阴性。2.3体温变化情况采用CDV组织匀浆攻毒后，对照组于35d出现第I次发热，体温达到39.841.0°C,间隔5d后又有3只犬出现了第2次发热，而另2只犬基本正常，随后在攻毒第15天后其中2只犬体温下降到37

17、°C以下，DNA免疫组除攻毒开始后有短暂的体温升高后，其余体温基本正常（图1）。图1免疫犬和对照犬人工感染CDV后体温变化曲线I#5#犬为对照组;免疫组犬数值为平均数犬壬壬2.4临床症状对照组犬攻毒后第3天出现厌食,眼角可见脓性或浆液性分泌物，表现出畏光，两眼不能完全睁开；有3只犬出现咳嗽、I区比，粪便带有粘液或呈西红柿酱样（血便），继而表现为弓背、魂卜，腹式呼吸，食欲废绝,并于攻毒后第16天有2只犬死亡，另1只症状明显。试验组除开始几天内有食欲减退外,其余未见以上症状。2.5尸体剖检和病理组织学观察对照组病死犬和症状明显犬（共3只）病理剖检及组织学病变显著:肺可见陈旧性出血点、实变

18、病灶，两肺不同程度受累，切面可挤出带泡沫的血性浆液，显微镜下主要呈现代偿性肺气肿、肺实变和细支气管炎；肝微肿质脆,肝细胞呈水样变性、脂肪变性及气球样变性；胆囊充盈胆汁墨绿;脾微肿，组织结构呈退行性变化；胃空虚，肠系膜淋巴结肿大，小肠肠壁增厚并有少许出血，小肠黏膜上皮细胞变性、坏死脱落，肠壁水肿,有多少不等的炎细胞浸润；脑可见软化灶。对照组另2只犬除见肺上有少量陈旧性出血点，未能观察到特征性变化。试验组脏器均正常。2.6RT2PCR检测攻毒后外周血中病毒RNA采用CDV核衣壳蛋白（N）基因的引物对试验犬外周血单核细胞的RNA进行RT2PCR扩增（图2）<>结果显示，除对照组5只犬的外

19、周血样品中扩增出CDVN蛋白基因约890bp片段外.DNA免疫组的犬均未扩增出特异性条带。3讨论一般认为，CDV囊膜糖蛋白是产生中和抗体的重要抗原，可激发机体强烈的体液免疫，而且两囊膜K12345678910111213141516K12345678910111213141516图2以外周血淋巴细胞RNA为模板作CDV核蛋白基因片段的RT2PCR扩增结果M.DL2000Marker;I.阳性对照（以OP株为模板）;2.DNA免疫组未能扩增特异条带;1216.对照组犬扩增出890bp条带2000-.糖蛋白上均含有相应的T淋巴细胞表位，其在动物体内诱导的细胞免疫与中和抗体在抗病毒免疫中占有重要地位

20、。同时另1个蛋白核衣壳蛋白（N）在病毒早期感染时可引起强烈的抗体反应g,且其上也含有T细胞表位们，在细胞免疫方面发挥了重要作用，因此有些学者也将该蛋白基因构建了DNA疫苗的载体，并取得了一定成效1,01o本试验利用构建的pcDNA2F、pcDNA2H利pcDNA2N质粒DNA与PEI混合后免疫CDV抗体阴性犬,攻毒后，对照组大部分犬出现了典型症状和病理变化，并有2只犬在攻毒后第16天死亡，另有1只犬症状明显，外周血淋巴细胞中均能检测到病毒RNA,而DNA免疫组除出现一过性体温升高和食欲减退外，其他未见明显的症状,RT2PCR扩增也均为阴性。该结果表明,CDVDNA疫苗免疫对机体可产生保护力，能

21、抵抗致病性毒株的攻击,并对体内病毒的消除发挥了重要作用。然而在对其ELISA抗体和病毒中和抗体检测时发现，虽然在免疫过程中及攻毒前能检测出血清中抗体水平，但总体滴度偏低，ELISA抗体滴度最高达|0205±Q中和抗体最高达10-5土QWO。CDV弱毒疫苗激发的体液免疫水平与免疫保护是密切相关的,特别是抗糖蛋白抗体出现的早晚以及含量的高低被认为是抗CDV感染的重要因素。机体感染CDV后，动物的康复与其产生的高水平IgG相关,康复犬的抗体滴度最高,致死性感染犬的抗体很少，乃至没有。一般认为犬的中和抗体滴度在10以上者均能完全保护其不受CDV的攻击“，而木试验在攻毒前中和抗体均未能达到临界

22、保护线。然而经DNA免疫的试验犬对病毒攻击却能提供较好的保护,这种现象在其他一些病毒的DNA免疫中也同样存在，分析其原因，己有学者认为在DNA免疫提供的保护上,细胞免疫可能占有主导地位，其中主要是CD8'T淋巴细胞的激活及其对靶细胞的杀灭。DNA免疫宿主细胞后，细胞内的外源蛋白被分裂成短肽(8-10个氨基酸)，通过膜相关输送器进入到内质网并与MHC2I类分子结合，这些MHC2I类分子/病毒蛋白肽复合物被提呈到细胞表面，继而刺激CD8+CTL引起细胞介导的免疫。而抗体的产生有赖于B细胞识别进入细胞表面或间隙的完整蛋白，因而分泌性抗原可更有效的活化B细胞以危。然而DNA免疫产生的蛋白和天然

23、病毒感染有很大的差别：其产生的抗原蛋白是非细胞病变性的，因此不会导致细胞裂解，而旦许多编码蛋白既不展示至细胞表面也不分泌到细胞外部,这些非分泌性抗原是如何释放到胞外的，目前还没有明确的答案，可能与以下因素相关：CTL细胞介导的特异杀伤溶解作用，转染细胞死亡后裂解释放，所以抗体反应缓慢得多。可以推测CDVDNA疫苗中细胞免疫同样发挥着极其重要的作用，这也可用在两个囊膜糖蛋白和核蛋白上均含有相应的T淋巴细胞表位，在小鼠和犬体内均能诱发较高水平的细胞免疫来解释。本试验DNA免疫中使用了阳离子聚合体PEI,与200UgDNA混合免疫后激发的抗体水平比Ch2erpillod等顷报道的200奖裸DNA免疫

24、要高，这可能由于本试验中免疫剂量略大，或者阳离子聚合体PEI的作用，或者与两者的协同效应有关。也有报道一次大剂量(0.51mg)DNA免疫后可激发机体较强的体液免疫水平心。但是否存在着剂量效应，还颇有争议。另外值得关注的是，与CDV具有较大抗原交又的麻疹病毒DNA疫苗研究中，Po2lack等5报道采用麻疹病毒2个囊膜糖蛋白H和F基因重组质粒DNA一次免疫便口J在恒河猴体内激发显著水平的中和抗体。在这个试骑中他们采用了较大剂量的质粒DNA(每种质粒500Ug)，选用了皮下注射。在皮肤接种过程中有试验证明，角化细胞和朗罕氏细胞是质粒DNA转染最主要的APC细胞，能够在转染之后有效地表达病毒蛋白,并

25、从皮肤迁移至淋巳结，进而激活T细胞"刃，从而比肌细胞具有更好的抗原提呈能力,在一些动物模型中使用皮肤接种比肌肉注射能激发更好的免疫应答1,61o当然在犬体内是否存在同样的优越性还需进一步的研究。虽然本试验在整个免疫过程中未能检测出高水平的抗体,然而在攻毒后2周无论是血清中ELISA抗体，还是中和抗体均迅速上升，这与Cherpillod等顷的试验结果相-致。这表明DNA免疫在攻毒前未能激发高水平的体液免疫，并不是该种免疫方式存在免疫耐受现象，在攻毒后短时间内抗体水平的升高，可能是抗体的一种免疫记忆效应，机体经DNA免疫后产生了大量的记忆细胞或浆细胞的前身细胞，一旦采用病毒攻击后,它们在

26、短时间内迅速地转化为浆细胞而产生高水平的抗体，从而提供了有效的免疫保护，这种推断仍需试验来证实。此外，在攻毒后对照组犬也检测出102,42±ftJ55的ELISA抗体,但未能检测出明显的申和抗体。我们认为在CDV野毒接种后，在这些动物体内只激发了针对核衣壳蛋白的低水平抗体，而且该水平抗体不能对机体产生完全的免疫保护。本试验构建的CDV的囊膜糖蛋白和核蛋白基因的重组质粒在自然宿主体内的免疫反应和保护力进行了初步的尝试。虽然攻毒后对照组和试验组间存在着明显的区别，但对照组犬未能全部死亡，由于CDV野毒株在适应细胞后其毒力大大降低，且不可能致死犬,如将病毒组织匀浆在易感宿主狐、雪貂机体复壮

27、后攻毒可提高犬的致死率。在犬瘟热DNA疫苗研究中，须在免疫途径、免疫剂量以及与细胞因子和佐剂的协调作用上作深入的探讨，以期提高DNA疫苗免疫激发的抗体水平。参考文献：1|KodihalliS,GotoH,KobasaDL,ctal.DNAvaccineencodinghemagglutininprovidesprolcciiveinununityagainstHSMinfluenzavirusinfectioninmiceJ|.JVirol,1999,73:209422098.I2OttenGR.DoeB,SchaeferM,etal.Relativepotencyofcellularandh

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