猪圆环病毒2型疫苗的研究进展.docx

1、畜牧兽医学报2012,43(9):1337-1345ActaVeterinariaetZootechnicaSinica猪圆环病毒2型疫苗的研究进展王一平，郭龙军，唐青海，刘长明收稿日期：2012-04-05基金项目：国家自然科学基金项R(31101837)；公益性行业(农业)科研专项(201203039)；863项目(2011AA10A208)作者简介：王一平(1987-),男，四川芦山人，硕士生，主要从事动物病毒学研究，E-mail:wangyipingl987yahoo,通讯作者：刘长明，研究员9E-mail:lcm,Tel：(+86Fax；0451-82733

2、132(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，哈尔滨150001)摘要：猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，给全球养猪业造成了巨大经济损失。PCV2感染可以破坏动物机体的免疫系统，造成严重的免疫抑制，容易诱发多种细菌及病毒的混合感染与继发感染，给疾病的诊断和治疗带来巨大的困难。疫苗免疫接种是防控PCV2感染的有效手段，有关PCV2疫苗的研究已成为国内外学者的关注热点。迄今为止，欧美几家跨国公司已先后推出商品化的PCV2灭活疫苗、亚单位疫苗及嵌合病毒疫苗，国内也已研制出PCV2灭活疫苗，这些疫苗的推广应用为有效防控猪

3、圆环病毒病发挥了重要作用。鉴于这些疫苗尚不能完全阻断PCV2传播，无法彻底清除体内感染的病毒，因此，开发高效、价廉的新型活载体疫苗、核酸疫苗及标记疫苗是今后研究的趋势。笔者在本文中概括地介绍了目前商品化的PCV2疫苗的特性和免疫效力，并对近年来有关PCV2活载体疫苗、核酸疫苗及标记疫苗等新型疫苗的研究进展进行综述，以期为猪圆环病毒病的防制提供参考。关键词：猪圆环病毒2型；疫苗；研究中图分类号：S858.285.3文献标识码：A文章编号：0366-6964(2012)09-1337-09ResearchProgressonVaccinesofPorcineCircovirusType2WANGY

4、i-ping,GUOLong-jun,TANGQing-hai,LIUChang-ming*(DivisionofSunneInfectiousDiseases，StateKeylaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute9ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin1500019China)Abstract:Porcinecircovirustype2(PCV2)hasbeenrecognizedastheprimarycausativeagentofpos

5、tweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS),whichresultsintremendouseconomiclossesinswineindustryworldwide.PCV2infectionleadstoimpairedimmunesysteminanimals,severeimmunosuppressionaswellasco-infectionandsecondaryinfectionamongvariousbacteriaandviruses»whichwillbringabouttremendousobstaclesindiag

6、nosisandtherapy.ItisaneffectivewaytocontrolPCV2infectionbyvaccination.ThestudyonPCV2vaccinesisoneofthehotresearchareas.Todate,theinactivatedvaccinesofPCV2,subunitvaccinesandchimericvirusvaccinesarecommerciallyavailableinNorthAmericaandEuropeandtheinactivatedvaccinesofPCV2havealsobeendevelopedinChina

7、.DevelopmentandapplicationofthecommercialPCV2vaccinesplayasignificantroleinthepreventionandcontrolofPCV2associateddiseasese任actively.However,thecommercialPCV2vaccinescouldnottotallyblockthetransmissionofPCV2a-mongpigsandeliminatethevirusinpigs.Therefore,itisthemainresearchtrendtodevelopefficientandi

8、nexpensivegeneticallyengineeredvaccinessuchaslivevectorvaccines,DNAvaccinesandmarkervaccinesinthefuture.ThisarticlesummarizesthecharacteristicsandefficacyofcurrentlycommercialPCV2vaccines,andreviewstherecentachievementsonPCV2vaccinesincludinglivevectorvaccines,DNAvaccinesandmarkervaccines.Itmaybecom

9、eausefulcontributortothenextgenerationvaccinesforcontrolofPCV2-associateddiseases.Keywords:porcinecircovirustype2；vaccines；research猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype29PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postw-eaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS）的主要病原，自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中流行十分严重，临床上常与猪高致病性繁殖与呼吸综合征、猪口

10、蹄疫以及猪细小病毒病等混合感染、继发感染，给全世界养猪业造成了重大的经济损失3】。PCV2不仅是引起PMWS的病原体，而且还与猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤（CT）、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎及渗出性表皮炎等疾病密切相关,这些与PCV2相关的疾病统称为猪圆环病毒病（Porcinecircovirusdisease,PCVD）。PCV2感染可以破坏动物机体的免疫系统，造成严重的免疫抑制，容易诱发多种细菌及病毒的混合感染与继发感染，给疾病的诊断和治疗带来巨大的困难。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种共价闭合、单股环状负链DN

11、A病毒，呈二十面体对称，无囊膜。PCV2病毒粒子直径为17nm,基因组大小约1.7kb,是目前发现的最小的动物病毒PCV2的基因组结构存在11个开放阅读框（ORFs）,即ORF1ORFIRORFs之间大小相差悬殊，所编码的蛋白大小在236kuoORF1与ORF2是PCV2最大的2个开放阅读框，分别编码与病毒复制相关的蛋白Rep和Rep，以及病毒的结构蛋白Cap*】。Cap蛋白作为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，是PCV2的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生特异性免疫应答,是研制PCV2基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。（）RF3为病毒复制的非必需基因，其编码的蛋白可诱导PCV2感染的细

12、胞发生凋亡。许多学者在PCV2基因组结构与功能方面开展了大量研究，除ORF1.ORF2与ORF3的功能研究较为透彻外，其他ORFs的功能尚不十分清楚'J。疫苗免疫接种是防控PCVD的有效手段，国内外学者在PCV2疫苗研究方面开展了大量研究，取得了显著成就，目前研制成功的PCV2商品化疫苗共有7种（表1）3E，这些疫苗的推广应用为有效防控PCV2感染发挥了重要作用。此外，在PCV2活载体疫苗、核酸疫苗及标记疫苗等新型基因工程疫苗的研究方面也取得了突破性进展，有望实现商品化。作者概述了近年来有关PCV2疫苗取得的研究进展，以期为开发新型疫苗提供借鉴。1PCV2灭活疫苗PCV2灭活疫苗是将P

13、CV2感染的细胞培养物通过理化方法处理，使其丧失感染性但仍保持良好的免疫原性，然后加入佐剂乳化制备而成。该类疫苗具有使用安全，易于保存，性能稳定等优点。国外学者较早投入PCV2灭活疫苗的研究工作中，法国梅里亚公司于2006年成功研制出通过欧盟认证的首例PCV2全病毒灭活疫苗Circovac®oOpriessnig等研究发现，用Circovac®免疫妊娠母猪和仔猪均能降低仔猪PCV2病毒血症和各组织器官中病毒载量，促进新生仔猪的生长，其原因可能是由于在给妊娠母猪注射疫苗后，诱导机体产生了抗PCV2的特异性抗体，仔猪通过吮吸初乳获得了抵抗PCV2感染的被动免疫力。Kurmann

14、等用该疫苗免疫PCV2亚临床感染的母猪，共分3次免疫，首免和二免分别在妊娠前4周和2周进行，三免在妊娠期第12周进行，结果发现免疫母猪的血清抗体水平比未免疫母猪的血清抗体水平提高了39倍，新生仔猪的血清抗体水平也随之增加，并能提高仔猪平均日增重率，缩短仔猪育肥期。由此可见，Circovac®具备优良的免疫效果，能使免疫母猪和免疫仔猪获得稳定的群体免疫力，保护其免受PCV2感染。在国内，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘长明研究员成功地研制出中国首例PCV2灭活疫苗（LG株），该疫苗具有抗原含量高、免疫原性强、安全性好、抗母源抗体干扰及免疫效果好等特点，临床试验结果表明，疫苗接种猪群与空

15、白对照组对比，主动免疫仔猪发病率下降15.1%,死淘率下降3.6%；被动免疫母猪结果显示，出生时死胎率下降2.3%,初生仔猪成活率提高7.6%,断奶时成活率提高7.5%。该疫苗的使用对我国PCV2流行有效地进行防控，给养猪业带来巨大的经济效益。此外，南京农业大学姜平教授研制的PCV2灭活疫苗（SH株）也已注册上市，目前正在全国大部分地区推广使用，展用对防控我国PCV2感染发挥了重大作用。现出广阔的应用前景。这2种疫苗的成功研制和应表1国内外PCV2商品化疫苗及其特征Table1Characteristicsofthecommerciallydomesticandinternationalvac

16、cinesofPCV2公司疫苗名称抗原成分类型佐剂免疫猪群CompanyVaccinenameAntigenTypeAdjuvantUsage梅里亚MerialCircovac®灭活的PCV2a全病毒InactivatedwholevirusofPCV2a灭活疫苗Inactivatedvaccine矿物油佐剂Mineraloiladjuvant母猪及3周龄以上仔猪Breedingsows/Piglets>3weeksold勃林格BoehringerIngelheimIngelvacPCV2a-Cap蛋白CapsidproteinofPCV2a亚单位疫苗水质佐剂3周龄以上Circ

17、oFLEX®SubunitvaccineImpranFLEXPiglets>3weeksold英特威IntervetCircumvent®PCV2a-Cap蛋白CapsidproteinofPCV2a亚单位疫苗Subunitvaccine水质佐剂ImpranFLEX3周龄以上Piglets>3weeksold先灵葆雅Schering-PloughPorcilis®PCVPCV2a-Cap蛋白CapsidproteinofPCV2a亚单位疫苗Subunitvaccine水质佐剂ImpranFLEX3日龄以上Piglets>3daysold富道/辉瑞

18、Fortdodge/PfizerSuvaxyn®PCV2OneDose/FosteraPCV灭活的PCV1-2嵌合病毒InactivatedPCV1-2chimera嵌合疫苗ChimericvirusvaccineSLCD水质佐剂SLCDImpranFLEX4周龄以上Piglets>4weeksold上海海利/哈尔滨维科SHANGHAIHILE/HarbinWEIKE圆毕净/PCV2灭活疫苗(LG株)YUANBIJING/InactivatedvaccineofPCV2(StrainLG)灭活的PCV2a全病毒(LG株)InactivatedwholevirusofPCV2a(

19、StrainLG)灭活疫苗Inactivatedvaccine免疫佐剂/水包油佐剂Immunoadjuvant/Oil-in-wateradjuvant母猪及3周龄以上仔猪Breedingsows/Pig】ets>3weeksold南农高科/洛阳普莱柯NANNONGHI-TECH/LUOYANGPULIKE圆克清/圆健灭活的PCV2b全病毒（SH株）灭活疫苗水包油包水双相佐剂Water-in-oil-in-waterduplexadjuvants母猪及3周龄以上仔猪YUANKEQING/YUANJIANInactivatedwholevirusofPCV2b(StrainSH)Inact

20、ivatedvaccineBreedingsows/Piglets>3weeksold2PCV2弱毒疫苗弱毒疫苗又称为减毒活疫苗，是将病原体的致病力通过自然筛选或人工致弱等方式减弱制备而成。尽管该类疫苗的毒力已经致弱，但仍然保持着原有的免疫原性,并能在动物体内繁殖，刺激动物机体免疫系统，从而诱导产生坚实的免疫力和持久的保护力。国内外对PCV2弱毒疫苗研究的报道较少，目前还没有商品化的PCV2弱毒疫苗，主要原因可能与病毒毒力易返强、致弱毒株毒力评价困难等因素有关。Fenaux等"将PCV2分离株在PK15细胞上连续传代培养，结果发现第120代病毒(VP120)滴度约为第1代病毒(

21、VP1)滴度的10倍，VP120感染的仔猪出现病毒血症的发生率明显低于VP1感染的仔猪，并且感染仔猪的血清中PCV2DNA拷贝数更低，眼观和病理组织学变化也更轻，表明体外传代可促进PCV2在细胞内的繁殖能力，并能减弱其致病力，这为研制PCV2弱毒疫苗提供了科学依据。由于单一PCV2感染对猪的致病性并不十分典型,病毒在体内持续存在，其毒力是否返强等关键问题没有阐明，试验数据有限，这种方法得到的毒力减弱毒株作为疫苗离应用还有很长的路要走。3PCV2基因工程疫苗3.1PCV2亚单位疫苗Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白和免疫保护性抗原，能刺激动物机体产生针对PCV2的特异性免疫应答，是研制PCV2基

22、因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2亚单位疫苗生产的表达系统主要是昆虫细胞/杆状病毒表达系统。国外已有3种PCV2亚单位疫苗注册上市，分别是勃林格公司研制的IngelvacCircoFLEX®,英特威公司研制的Circumvent®以及先灵葆雅公司研制的Porcilis®PCV,这3种疫苗均为杆状病毒表达的Cap蛋白亚单位疫苗"'I。Opriessnig等邸比较了单剂量的IngelvacCircoFLEX®和两剂量的Circumvent®对3周龄以上仔猪的免疫保护效力，结果发现在用PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PR

23、RSV)及猪流感病毒(SIV)感染免疫仔猪后，无论以单剂量还是两剂量疫苗免疫，均能明显降低病毒血症的发生率，减轻PCV2.PRRSV及SIV混合感染对淋巴组织的损伤。Fort等研究了单剂量Porcilis®PCV对不同地区、不同基因型PCV2感染的免疫保护效果，结果发现该疫苗对来自不同地区、不同基因型的PCV2感染具有良好的免疫保护力，既能诱导免疫仔猪产生针对PCV2的特异性体液免疫应答，又能诱导产生细胞免疫应答,能显著减轻病毒血症，减少鼻腔和排泄物中PCV2的排出量，降低各组织器官中PCV2的病毒载量。由于PCV2亚单位疫苗研究和开发的费用较为昂贵，中国在这一领域的投入相对较为薄弱

24、，目前还没有PCV2亚单位疫苗注册上市。刘长明等采用昆虫杆状病毒表达系统成功表达PCV2Cap蛋白,Westernblot检测结果显示重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应，证实该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。张家明口们采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达PCV2Cap蛋白，由Cap蛋白制备的亚单位疫苗免疫小鼠后能诱导产生抗PCV2的特异性抗体，表明表达的Cap蛋白具有良好的免疫原性。尽管中国科研人员在PCV2亚单位疫苗研究方面开展了许多研究工作，但要想实现该类疫苗的商品化应用，就必须探索出一套能够高效表达Cap蛋白的表达系统，减少研发的费用，从根本上降低疫苗的生产成本，

25、提高疫苗的免疫保护效力。3.2重组PCV2活载体疫苗3.2.1PCV2病毒活载体疫苗腺病毒活载体疫苗：腺病毒作为基因转移载体具有诸多优势：宿主范围广，插入外源基因能力强，能在许多哺乳动物细胞和组织中表达重组蛋白，表达外源基因效率高，能对表达的外源蛋白进行精细的修饰。基于以上优势，腺病毒载体现已广泛应用于基因工程疫苗研发，基因治疗以及肿瘤治疗等领域岫oWang等玲23成功构建了表达PCV2ORF2基因的重组腺病毒rAd-Cap,然后通过动物免疫保护试验评价rAd-Cap对仔猪的免疫保护效果，结果发现，在首免后37d即能检测到抗PCV2的高水平EL1SA抗体和病毒中和抗体，免疫仔猪的

26、相对日增体质量率显著高于攻毒对照组，而组织损伤程度和病毒血症的发生率却明显低于攻毒对照组。Liu等S成功构建了融合表达PCV2ORF2基因与猪IFN-y基因的重组腺病毒rAd-ORF2-IFN-”并证实rAd-ORF2-IFN-y在小鼠体内诱导产生PCV2特异性抗体的能力比单独表达Cap蛋白的rAd()RF2强，表明猪IFN-y作为细胞因子佐剂可以显著增强Cap蛋白的免疫原性。由此可见，表达Cap蛋白的重组腺病毒能诱导动物机体产生针对PCV2的特异性免疫应答，保护动物抵抗PCV2感染，是一种具有潜在应用价值的PCV2候选疫苗。然而，腺病毒作为表达载体也存在些许不足，如腺病毒载体由于不能整合到靶

27、细胞的基因组DNA中,因此不能形成外源基因的稳定表达；腺病毒的靶向性差；腺病毒颗粒可被肝脏的Kupffer细胞非特异性吸收，表现出很强的首过效应等。因此，只有对腺病毒载体不断进行改进和完善，才能充分发挥其潜在的应用价值。伪狂犬病毒活载体疫苗：伪狂犬病毒基因组是线状双链DNA分子，大小约150kb,含有许多病毒非必需基因，可以插入和表达多种病原体的免疫保护性抗原基因。伪狂犬病毒较稳定，免疫原性持久；缺失毒力基因的伪狂犬病毒安全性好，能诱导动物机体产生持续的体液免疫与细胞免疫应答，因此，该病毒已逐渐发展成为哺乳动物细胞系统的高效表达载体之一，广泛应用于基因工程药物和基因工程疫苗的开发

28、与研制等领域oJu等成功构建了表达PCV2ORF1-ORF2融合蛋白的重组伪狂犬病毒PRV-PCV2,Westernblot试验证实ORF1-ORF2融合蛋白在重组病毒中正确表达，用PRV-PCV2免疫小鼠后，能在小鼠体内诱导产生抗PRV和PCV2的特异性抗体，保护小鼠抵抗PRVEa强毒株攻击；而且，仔猪免疫试验也证实PRV-PCV2能诱导仔猪产生针对PRV和PCV2的特异性免疫应答。Song等肉将PCV2ORF2基因插入pIEC-MV质粒中，并同伪狂犬病毒Tk-/gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，通过同源重组成功构建了Tk7gE-/ORF2重组病毒,Westernblot和间接

29、免疫荧光试验证实PCV2ORF2基因在重组病毒中正确表达。4周龄仔猪接种Tk-/gE-/ORF2后，PRVELISA、PRV-中和试验、（）RF2-ELISA和ORF2特异性淋巳细胞增殖试验证实重组病毒具有良好的免疫原性，能产生针对PRV和PCV2的特异性免疫应答。由此可见，重组伪狂犬病病毒能诱导动物机体产生针对PRV和PCV2的特异性免疫应答,保护动物抵抗PRV和PCV2感染，与重组腺病毒对比，该重组伪狂犬病毒能在猪体内很好地繁殖，因此，在PRV-PCV2二联活载体疫苗研制方面具有巨大的潜力和应用价值。32.1.3假型杆状病毒载体疫苗：Fan等将水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因克隆至杆

30、状病毒转移载体pFastBacl多角体蛋白基因启动子下游，并在VSV-G表达元件下游引入巨细胞病毒早期（CMV-IE）启动子和BGHpoly（A）,成功构建了一种类似杆状病毒的假型杆状病毒BV-G-CMV,但其能感染哺乳动物细胞，并能在病毒粒子囊膜展示VSV-G。随后，Fan等08将PCV2ORF2基因定向插入BV-G-CMVCMV-IE启动子下游，转染Sf9昆虫细胞后获得了重组假型杆状病毒BV-GORF2,Westernblot与流式细胞术检测结果显示BV-G-ORF2能在PK15细胞中高效表达Cap蛋白。以1X108或1X109PFU剂量的BV-G-ORF2免疫小鼠，结果发现能诱导小鼠产生

31、抗PCV2特异性ELISA抗体、中和抗体及细胞免疫应答，而且即使以1X108PFU剂量免疫,BVGORF2也展现出比PCV2DNA疫苗更强的免疫原性。BV-G-CMV作为基因转移载休具有操作简单、病毒易培养、无毒性、免疫原性强及宿主体内不存在抗杆状病毒的抗体等优点，因此，假型杆状病毒可用于新型PCV2活载体疫苗的研究。猪繁殖与呼吸综合征病毒载体疫苗：Pei等mJ在PRRSVcDNA克隆的ORFslb与2a之间插入2个限制性酶切位点和1个转录调控序列TRS6,将其改造成一个通用的病毒载体，然后将PCV2ORF2基因插入2个限制性酶切位点之间，由TRS6启动转录，构建了表达Cap蛋白

32、的重组质粒，用重组质粒转染Marc-145细胞成功获得了P129-PCV重组PRRSV0动物免疫试验证实：免疫5周后，在P129-PCV免疫的猪体内能诱导产生抗PCV2特异性抗体应答，表明重组PRRSV能在体内和体外成功表达Cap蛋白，并诱发特异性免疫应答，可作为一种表达载体用于PCV2及其他猪病活载体疫苗的研究。然而，该重组PRRSV体外传代是否稳定、目的基因经传代是否会丢失等问题有待进一步的试验数据加以证实。噬菌体载体疫苗：研究表明，噬菌体表面展示技术现已应用于疫苗的开发与研究。将病原体的保护性抗原与噬菌体的外壳蛋白以融合蛋白形式展示于噬菌体的表面，以此来构建表达外源抗原的重

33、组噬菌体颗粒，即噬菌体载体疫苗列。噬菌体载体疫苗因安全，稳定，不需要佐剂及易于规模化生产等特点而日益受到研究人员的重视。Gamage等将PCV2Cap蛋白的优势表位区克隆至入噬菌体展示颗粒（LDP）头部蛋白（D）基因下游形成融合基因，成功构建了表达融合蛋白D-CAP的重组X噬菌体展示载体LDP-D-CAP,ELISA和Westernblot检测结果显示D-CAP在LDP的表面正确表达，用LDP-I>CAP免疫仔猪后，没有出现任何不良反应,首免后即可诱导产生抗PCV2的特异性免疫反应，不仅能诱导产生PCV2中和抗体，而且能诱导产生细胞免疫应答，表明PCV2噬菌体载体疫苗有望作为一种新型的活

34、载体疫苗用于防控PCV2感染。3.2.2PCV2细菌活载体疫苗乳酸菌口服活载体疫苗：乳酸菌在食品工业中具有广泛的应用，是一类安全的口服细菌，可以作为活疫苗载体表达外源抗原，因而日益受到研究者的重视3】。Wang等购将缺失核定位信号区的PCV2ORF2基因克隆入大肠杆菌/乳酸链球菌穿梭载体pSEC：LEISS,构建了重组穿梭载体pSEC：LElSS-dCap,电转化乳酸菌后获得了重组乳酸菌NZ9000/pSEC：LEISSdCap,Westernblot试验证实Cap蛋白在乳酸链球菌中正确表达，在给小鼠口服重组乳酸链球菌培养物后可检测到高水平的PCV2特异性抗体，表明乳酸链球菌作为

35、抗原转移载体可用于PCV2口服活疫苗的研发，具有开发潜力和应用前景。博德特氏菌载体疫苗：研究证实，支气管炎博德特氏菌具有很强的感染性，这使得其很容易定植于呼吸道黏膜，因此，应用致弱的支气管炎博德特氏菌作为活载体将异种抗原递呈至哺乳动物乃至人的呼吸道是可以实现的w。Kim等35将PCV2ORF2基因定向克隆入aroA突变的支气管炎博德特氏菌，电转化后获得了表达Cap蛋白的重组博德特氏菌（BBS-MCP）,然后用活BBS-MCP免疫小鼠和猪，ELISA检测结果显示在血清中存在高水平的抗Cap蛋白特异性IgG抗体，用PCV2感染后，在活BBS-MCP免疫的猪淋巴结中检测不到PCV2DN

36、A,结果表明BBS-MCP免疫能有效保护猪群抵抗PCV2感染，这一发现为PCV2减毒活疫苗的研发提供了新的思路。此外，酵母表达系统作为一种真核表达系统，因其操作简单、细胞生长快速、能大规模发酵生产，而且能对重组蛋白进行相对正确的折叠和翻译后加工修饰等优点，现已广泛应用于外源蛋白的商品化疫苗研发。Bucarey等家】将PCV2Cap蛋白基因密码子优化后克隆入大肠杆菌/酿酒酵母穿梭载体（pY-ES2）,然后转化宿主菌INVScl,Westernblot试验证实Cap蛋白在酵母细胞中正确表达，电镜下观察到Cap蛋白表达后可以自我组装形成类似PCV2的病毒样颗粒，给小鼠口服含Cap蛋白的酵母提取物后，

37、在血清中可检测到抗Cap蛋白的特异性抗体，表明酿酒酵母作为一种非常有吸引力的表达载体可用于PCV2口服活疫苗的研制。3.3 PCV2核酸疫苗核酸疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，因免疫效果好，免疫应答持久，制备简便，稳定性强，安全性好，成本低廉，适于规模化生产等优点，现已成为疫苗学领域研究的热点。研究证实，含PCV20RF2基因的质粒载体（P0RF2）能在小鼠体内诱导PCV2特异性抗体阳转，能诱导仔猪产生抗PCV2感染的保护性免疫应答逐,而且PORF2免疫的小鼠诱导产生PCV2中和抗体的能力比单独用Cap蛋白免疫的小鼠强，攻毒后免疫组小鼠临床症状和病理变化明显减轻，PCV2病毒载量也显著下降网。

38、Fenaux等眄用PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗免疫仔猪,免疫后42d,检测到大部分仔猪PCV2抗体阳转，攻毒后21d,对照组仔猪出现病毒血症，淋巴结肿大，淋巴组织衰竭等症状，而免疫组仔猪未出现病毒血症，淋巴组织损伤程度较轻，淋巴组织的病毒载量显著降低，表明PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗可以有效预防PCV2感染。Aravindaram等分别构建了含PCV2ORF-l、ORF-2、ORF-3的重组质粒p3224-ORF-1、2和-3,3种重组质粒单独或联合免疫小鼠2周后，用相应的MVA-ORF-1.-2和-3以单独或联合形式加强免疫，结果发现ORF-2/-3与0RF-1/-2/3这2种组合免疫诱

39、导产生的IFN-y.TNF-a.GM-CSF以及PCV2抗体水平均较其它免疫组高，攻毒后这2种组合免疫组PCV2病毒载量显著减少，小鼠的肺部病变也明显减轻。尽管核酸疫苗具有诸多优点，但外源基因在体内的表达调控及其在体细胞中的转移可能会产生意外的免疫病理反应等瓶颈问题使得目前绝大部分核酸疫苗的研究还仅局限于实验室。3.4 PCV1-2嵌合疫苗嵌合疫苗是应用基因工程手段来构建的一类新型疫苗，美国富道公司已经研发出商品化的PCVP2嵌合疫苗Suvaxyn®PCV2OneDose,其原理是用PCV2ORF2基因置换无致病性的PCV1ORF2基因，构建PCV1-2嵌合病毒，然后将其灭活制备而成

40、,该类疫苗现已在美国、加拿大、墨西哥、丹麦、菲律宾及新西兰等国申请注册。2011年，美国辉瑞公司与富道公司合并后，将Suvaxyn®PCV2OneDo-seTM更名为FosteraPCVOSegales等以习对Su-vaxyn®-PCV2的免疫保护效力进行了研究，结果发现免疫猪群的临床症状大大减轻，淋巴组织和血液中PCV2的病毒载量、保育猪和育肥猪的死亡率以及PMWS的发生率均显著降低，表明Suvaxyn®-PCV2能有效诱导动物机体产生PCV2中和抗体,保护猪群抵抗PCV2感染，并降低PMWS的发生率，这与其他学者的研究结果一致W.43U5。众所周知，如果仔猪体

41、内存在母源抗体，将会干扰疫苗的免疫效能，为验证母源抗体的存在对Suvaxyn®PCV2OneDose免疫效能的影响，Opriessnig等不-选择有母源抗体存在的仔猪作为实臆动物，在Suvaxyn®PCV2OneDose免疫后28d进行PCV2感染试验，结果发现，与对照组对比，免疫组仔猪血清中PCV2病毒载量显著降低，淋巴组织损伤程度也明显减轻，表明即使存在母源抗体，Suvaxyn®PCV2OneDose仍能显著提高仔猪对PCV2感染的免疫力。3.5 PCV2标记疫苗PCV2标记疫苗是指应用DNA重组技术将分子标记插入PCV2基因组中而研制的一类新型的重组疫苗，该

42、类疫苗毒株可与野毒株相区别。Beach等将GLU或KT3标签定向克隆至PCV1-2嵌合病毒Cap蛋白的C末端，成功构建了2种带分子标记的PCV1-2嵌合病毒，并证实其能在PK15细胞上增殖，试验感染猪后能在血清中检测到PCV2中和抗体和抗GLU或KT3标签的特异性抗体。Huang等47将V5标签插入PCV2Cap蛋白的C末端，成功构建了表达V5标签的PCV2重组病毒，并证实重组病毒和亲本毒株具有相似的生物学特征，用重组病毒免疫小鼠后能诱导产生PCV2中和抗体和抗V5标签的特异性抗体。这些研究结果表明：带GLU或KT3标签的PCV1-2嵌合病毒或带V5标签的PCV2重组病毒有望作为研制PCV2标

43、记疫苗的候选疫苗株，为临床区分PCV2自然感染和疫苗免疫奠定了坚实的基础。4展望诸多PCV2疫苗效能试验已证实目前商品化的PCV2疫苗在一定程度上可以有效防控PCV2感染，能显著降低PCV2感染猪群的临床症状，提高猪的生长性能，然而疫苗免疫并不能完全阻断PCV2传播，亦不能完全清除体内已感染的病毒。此外，就目前商品化的PCV2疫苗而言，无论是国外进口的还是国产疫苗，市场价格普遍较高，这在一定程度上给养殖户造成了经济压力，因此，研制高效、低廉的新型疫苗是今后的必然趋势。总之,PCV2疫苗研究总体呈现出良好的发展态势，在国内外研究人员的不懈努力下，相继研制出PCV2全病毒灭活疫苗、PCVl-2嵌合

44、病毒疫苗及基于Cap蛋白的PCV2亚单位疫苗。随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，活载体疫苗、核酸疫苗及标记疫苗等PCV2新型基因工程疫苗正在研究中，展现出良好的应用前景。针对当前PCV2商品化疫苗生产成本较高、病毒难培养的现实，开发高效、低廉的PCV2新型活载体疫苗、核酸疫苗等基因工程疫苗是今后研究的趋势。参考文献：1ALLANGM,ELLISJA.Porcinecircoviruses：AreviewJ.VetDiagnInvest2000,12：3-14.2GUOLJ,LUYH,WEIYW,etal.Porcinecircovir-ustype2(PCV2):geneticvaria

45、tionandnewlyemerginggenotypesinChinaJ.VirolJ,2010,7(1):273._3SEGALESJ,ALLANGM,DOMINGOM.PorcinecircovirusdiseasesJ.AnimHealthResRep,2005,6(2):119-142.L4TISCHERI,GELDERBLOMH,VETTERMANNW,elaLAverysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNAJ.Nature91982,295；64-66.5CHEUNGAK.Transcriptionalanalysisofp

46、orcinecircovirusType2J.Virology,2003,305(1):168-180.6NAWAGITGULP,MOROZOWI,BOLINSR,etal.Openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidproteinJ.JGenVirol,200081(9):2281-2287.7LIUJ,CHENI,KWANGJ.Characterizationofapreviouslyunidentifiedviralproteininporcinecircovirustype2-infectedcellsandi

47、tsroleinvirus-inducedapoptosisJ.JVirol,2005,79(13)：8262-8274.E8RAMAMOORTHYS,MENGXJ.Porcinecircoviruses：aminusculeyetmammothparadoxJ.AnimHealthResRev2009»10(1)：1-20.9OPRIESSNIGT,MENGXJ,HALBURPG.Porcinecircovirustype2associateddisease：updateoncurrentterminology»clinicalmanifestations,pathoge

48、nesis,diagnosis,andinterventionstrategicsJ.JVetDiagnInvestt2OO7,19：591-615.10 KEKARAINENT,MCCULLOUGHK,FORTM,etal.Immuneresponsesandvaccine-inducedimmunityagainstPorcinecircovirustype2J.VetImmunolImmunop,2010,136：185-193.11 BEACHNM,MENGXJ.Efficacyandfutureprospectsofcommerciallyavailableandexperiment

49、alvaccinesagainstporcinecircovirustype2(PCV2)JVirusRes,2012,164：33-42.12 OPRIESSNIGT,PATTERSONAR,MADSONDM,etal.Comparisonoftheeffectivenessofpassive(dam)versusactive(piglet)immunizationagainstporcinecircovirustype2(PCV2)andimpactofpassivelyderivedPCV2vaccine-inducedimmunityonvaccination_JJ.Ve/Microb

50、iol,2010,142：177-183.13 KURMANNJ,SYDLERT,BRUGNERAE,etal.Vaccinationofdamsincreasesantibodytiterandimprovesgrowthparametersinfinisherpigssubclinical-lyinfectedwithporcinecircovirustype2J.ClinVaccineImmunol,2011,18(10):1644-1649.14 FENAUXM,OPRIESSNIGT,HALBURPG,etal.Twoaminoacidmutationsinthecapsidprot

51、einoftype2porcinecircovirus(PCV2)enhancedPCV2replicationinvitroandattenuatedthevirusinvivoEJ1JWro/,2004,78(24):13440-13446.15 OPRIESSNIGT,PATTERSONARMADSONDM,etal.ComparisonofefficacyofcommercialonedoseandtwodosePCV2vaccinesusingamixedPRRSV-PCV2-SIVclinicalinfectionmodel2-3monthspostvaccinationJ.Vac

52、cine,2009,27:1002-1007.16 FORTM,SIBILAM,PEREZ-MARTINE.etal.Onedoseofaporcinecircovirus2(PCV2)subunitvaccineadministeredto3-weekoldconventionalpigletselicitscell-mediatedimmunityandsignificantlyreducesPCV2viremiainanexperimentalmodelJ.Vac-2009,27(30)：4031-4037.17刘长明，陆月华，张超范，等.猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表

53、达J.中国预防兽医学报，2005,27(6)：479-482.18 张家明.猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达及亚单位疫苗的初步研究D.郑州：河南农业大学，2010.19 WESLEYRD,TANGM,LAGERKM.Protectionofweanedpigsbyvaccinationwithhumanadenovirus5recombinantvirusesexpressingthehemagglutininandthenucleoproteinofH3N2swineinfluenzavirusJVaccine,2004,22(34)：27-34.20 CHINSANG

54、ARAMJ,MORAESMP,KOSTERM,etal.Novelviraldiseasecontrolstrategy:adenovirusexpressingalphainterferonrapidlyprotectsswinefromfoot-and-mouthdiseaseJ,JVirol2003»77(162)：l-5.21 MASCOLAJR,SAMBORA,BEAUDRYK,etal.NeutralizingantibodieselicitedbyimmunizationofmonkeyswithDNAplasmidsandrecombinantadenoviralve

55、ctorsexpressinghumanimmunodeficiencyvirustype1proteinsJ.JVirol,2005,79(77):1-9.22 阪NGXW,JIANGWM,JIANGP,etal.Constructionandimmunogenicityofrecombinantadenovirusexpressingthecapsidproteinofporcinecircovirus2(PCV2)inmiceJVaccine,2006,24(16)：3374-3380.23 WANGXW,JIANGP,LIY,etal.Protectionofpigsagainstpo

56、st-weaningmultisystemicwastingsyndromebyarecombinantadenovirusexpressingthecapsidproteinofporcinecircovirustype2JVetMicrobi-况，2007,121(324):215-224.24 LIUGM,LUOML,CHENRA,etal.Constructionandimmunogenicityofrecombinantadenovirusex-pressingORF2ofPCV2andporcineIFN-gammaJ.Vaccine,2011,29：8677-8682.25 JU

57、C,FANHY,TANY,etal.ImmunogenicityofarecombinantpseudorabiesvirusexpressingORFl-ORF2fusionproteinofporcinecircovirustype2JVetMicrobiol,2005,109:179-190.26 SONGYFJINML,ZHANGSL,etal.Generationandimmunogenicityofarecombinantpseudorabiesvirusexpressingcapproteinofporcinecircovirustype2JlVetMicrobiol,2007J

58、19：97-104.27 FANY,XIAOS.FANGL,etal.Efficienttransductionofporcinekidneycellswithpseudotypebaculov-irusJ.JHuazhongAgricUniv2007,26478-481.28 FANHY,PANYH,FANGLR,etal.Constructionandimmunogenicityofrecombinantpseudotypebaculovirusexpressingthecapsidproteinofporcinecircovirustype2inmiceJ.JVirolMethods,2008*150：21-26.29 PEIYL,HODGINSDC,WUJQ,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusasavector：Immunogenicityofgreenfluorescentproteinandporcinecircovirustype2capsidex