病毒样颗粒疫苗的研究进展.docx

1、病毒祥颗粒疫苗的研究进展杨美庆，刘文权，梁韶晖(温州医科大学基础医学院，浙江温州325035)摘要病毒样颗U(VLPs)是一种由病毒的结构案白组成的，类似于天然病冬粒子空间结构的多聚体倾柱，具有很强的免疫原姓，可诱导全面的体液和舫胞免疫反应，是潜在安全的候选疫笛。本文就几种重要的VLPs疫苗的研完进展进行综述-关键词病孝样颗检；疫苗；研究进展；埃述文斌中图分类号R392文献标志码C文章编号1000-2138(2013)08-0558-041病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)的形成及免疫原性VLPs是通过将编码病露结构蛋白的基因插入到表达载体中，再转入原核或其核细胞中

2、进行表达而获得的高度结构化的空心蛋白颗粒m。不同病毒的VLPs组装特征各有不同。无包膜病毒或包膜病毒的核衣充VLPs的组装需要一个或多个核衣壳蛋白，即通过表达一个前体蛋白进而加工形成多个核衣壳蛋白，或者在同一个细胞内共表达多个核衣壳蛋白来进行自我组装。包膜病毒VLPs是由包膜蛋白进行组装或与核衣壳蛋白一起进行组装，且必须通过宿主细胞膜相关组分(如内质网、细胞膜，或者细胞膜相关的脂筏)的出芽，获得病毒颗粒的脂质包膜。有包膜的VLPs在形态结构上类似于病毒在自然感染过程中产生的不含核酸的亚病毒颗粒(subviralparticles,SVPs)。如通过酵母或哺乳动物细胞表达HBV包膜蛋白获得的VL

3、Ps与从HBV感染者血清中分离的SVPs大小均为22nm,旦不包含核衣壳。VLPs的结构与其诱导机体免疫反应的高效性密切相关MLPs作为免疫原，其优势表现在：首先、VLPs比可溶性的重组蛋白具有更接近天然病毒粒子的空间构象和抗原表位，在通常情况下能够刺激机体产生更强的免疫应答。而旦许多VLPs是由病毒的多个结构蛋白组装而成，基本保留了病毒的主要抗原表位，同时这些抗原表位被¥LPs以集中和高密度的方式呈现，因此其诱导体液免疫反应的高效性和持久性远胜于可溶性蛋白。其次，VLPs的颗粒形态使得其更容易被包括单核/巨噬细胞和收稿日期：2012-10-31基金项目：浙江省大学生科技创新活动计划

4、项目(新苗人才计划，2011R413013)；温州市科技局科研基金资助项目(Y20100002)；温州医学院人才启动项目(QTJ09022).作者简介：杨美庆(1989-).女，贸州资阳人，本科生。通信作者：刘文权,副教授Email：1iuwenquan307©126.com。树突状细胞(dendriticcells,DCs)在内的抗原提呈细胞(APC)所吞噬，从而有效的刺激CD4T细胞增殖和细胞毒性T细胞(CTL)反应"顷。尤其是一些VLPs仍保留病毒的受体结合区域，因此可以通过MHC-I类途径进行提呈，并活化CD8T细胞，以实现CD8，T细胞介导的保护性免疫反应AM。而

5、且，VLPs具有针对DCs的耙向性叫，因此，在没有任何佐剂的情况下VLPs仍可通过吞嘛、渗透及TLR受体介导等方式被DCs摄取，促进DCs的成熟和迁移，从而诱导较强的细胞免疫应答。正是由于VLPs具有上述免疫优势.让其成为了目前疫苗研究的热点。2VLPs疫苗的研究进展已经商品化的VLPs疫苗2.1.1 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus.HBV)疫苗：HBV疫苗是世界上首个基于VLPs技术制备的“非传统”病毒亚单位疫苗。它最早是从HBV感染患者血清中分离纯化含有HBV表面抗原(HBsAg)的SVPs制备而成，但该方法制备成本高，而且产被低。后来，研究者将编码HBV24kDa表面抗原基

6、因克隆至体外表达系统进行表达，发现可以获得与Sl'Ps类似结构的HBsAgVLPs,而旦具有良好的免疫保护效果，从而解决了HBVVLPs疫苗发展的瓶颈问题目前，已经上市的HBV疫苗是利用酵母和中国仓鼠卵集细胞(CHO)等表达系统制备的VLPs疫苗。从1982年至今，已有超过10亿人接种HBVVLPs疫苗，其有效率可达到95%，儿童因感染HBV引发慢性肝炎的发病率也从8%15%F降至不到戏叫。此外，基于HBV核心抗原HBcAgVLPs作为疫苗载体平台用于呈递不同的外源抗原表位或肿癖抗原也有诸多报道。2.1.2 人乳头瘤病毒(humanpapi1lomavirus，HPV)疫苗：HP

7、9;是引起宫颈癌的“罪魁祸首”，HPVVLPs也是目前研究得最多也是最为深入的VLPs疫苗。利用体外表达系统表达HPV的主要衣壳蛋白L1组装成的戏Ps具有很强的免疫原性，能有效剌激体液和细胞免疫应答，对机体产生保护作用眄。由于HPV有40多个型别，不同型别的VLPs引起的免疫反应具有高度型别特异性，仅高度同源的HPV型别之间(如HPV18和45,HPV16和31)有一定程度的交叉保护反应，因此一种型别的HPVLIVLPs难以交叉保护预防其他型别的感染(°HPVL2蛋白含有型交叉中和表位，能诱导型交叉保护抗体的产生，但其免疫原性不如由L】构成的VLPslulo因此，将HPVL1和L2共

8、表达形成嵌合VLPs,或者利用LIVLPs表达含有L2交叉中和表位的嵌合VLPs是发展HPV多价VLPs疫苗最常用的方法EE。目前，有两种HPVVLPs疫苗配方已经成功被FDA批准上市，并应用于临床。这两种VLPs都是特异的针对引起超过70%的宫颈癌的高危型HPV-16和HPV-18o其中一种疫苗是由GSK公司利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备的二价HPVVLPs疫苗，并利用单磷酰脂质A和TLR配基作为疫苗佐剂；另一种是由Merck公司开发的利用酿酒酵母表达包含HPV四个型(HPV16/18/11/6)的四价疫苗Gardasilln-12,e此外，利用RNA噬菌体PP7,展现HPVL2的广泛型

9、交叉中和表位能诱导小鼠产生对不同型HPV的保护作用邸。2.2 正在进行临床试验的VLPs疫苗2.2.1诺瓦克病毒(Norwalkvirus)VLPs疫苗：诺瓦克病毒是引起无菌性急性胃肠炎的重要病原体。由于缺乏适宜体外培养的细胞系，经体外表达诺瓦克病毒衣壳蛋白VP1组成的VLPs已被作为诊断抗原和候选疫苗mi。通过动物免疫试验证实，经口或鼻滴入途径的VLPs能蜉刺激机体产生包括IgG和IgA在内的全面体液免疫反应，显示了VLPs具有诱导针对诺瓦克病毒感染的免疫保护作用"引。通过昆虫细胞-杆状病毒系统和转基因植物表达系统制备的VLPs在入体的经口免疫临床试验中表现出了良好的安全性和免疫原

10、性。到目前为止，有两种形式的诺瓦克VLPs疫苗：冻干粉剂和液态疫苗联合不同的佐剂，正在进行人体I/II临床试检来评估该疫苗的安全性及对诺瓦克病毒临床感染的保护作用。2.2.2 流感病毒(influenzavirus)VLPs疫苗：近年来，流感病毒疫苗的研究日益受到重视。传统的灭活病毒疫苗不仅受制于鸡胚培养的有限产最,而且还深受因禽流感流行造成的鸡蛋原料不足的影响，无法满足社会需求。因此，利用体外表达系统制备的VLPs无疑是替代鸡胚生产方法的最好选择之一。目前，通过肝状病毒表达-昆虫细胞系统表达流感病毒H3N2的4个结构蛋白基因：Ml、M2、HA和NA,或H5N】、H1N】和H9N2的HA、NA

11、和Ml均可组装成VLPs购。在动物免疫实验中，流感VLPs可诱导比灭活病毒和重组HA更高滴度的抗体水平，和提供更广泛的交叉保护作用，从而抵御致命活病毒的攻击回。目前，H5N1和HllVLPs疫苗已经进入临床试验阶段来评估其安全性和有效性，如Novavax公司分别对H1N1(A/Ca1ifornia/04/2009)VLPs疫苗和三联流感VLPs疫苗(H1N1A/Brisbane/59/2007,H3N2A/Brisbane/10/2007.B/Florida/04/2006)的安全性、免疫耐受和免疫原性进行了临床试验评估。结果证明了VLPs疫苗具有良好的安全性和耐受性；并且和灭活病毒疫苗相比较

12、，VLPs疫苗在免疫21d后即可刺激机体产生强烈的针对所有疫苗病毒株HA和NA的抗体反应，以及不依赖剂量的免疫保护作用，这为流感疫苗的研制奠定了基础阿2。此外，有研究者利用HBV和HPV的衣壳蛋白基因和流感病毒的HA和NA蛋白基因进行融合表达可形成嵌合的流感VLPs网。基于HIVGag蛋白的逆转录病毒表达系统也被用于制备含流感病毒包膜蛋白的VLPs1232.3正在进行临床前试验的VLPs疫苗丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus.HCV)VLPs疫苗：HCV是引起输血后非甲非乙型肝炎的主要病原体，75%以上的感染者可转为慢性肝炎，并逐步发展为肝硬化和肝癌，尚缺乏有效的疫苗。利用杆状病毒和

13、昆虫细胞表达系统共表达HCV结构蛋白(C-E1-E2)可获得VLPsS将重组的VLPs免疫小鼠，可以有效的剌激机体细胞和体液免疫反应，其中CD4和CD8T淋伊细胞反应对于抵抗HCV感染起主要作用E2M。黑猩猩的免疫实验进一步证明HCVVLPs可被很好的耐受，并且可诱导产生广谱和长效的免疫反应1251oGarrone等闵借助逆转录病毒的Gag蛋白携带HCVla基因亚型的El和(或)E2包膜糖蛋白，形成假型(pseudotype)VLPso该假型VLP在小鼠和捞猴都能诱导很高的抗E1和(或)E2的抗体，同时对la型有很强的中和活性，并对所试验的其他5种HCV基因亚型(lb、2a、2b、4和5)也有

14、中和作用。2.3.1 人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)VLPs疫苗：由于HIV及其引发的艾滋病(AIDS)的防治日益严峻，因此HIVVLPs疫苗的研究也是热点之一。研究表明，HIV的结构蛋白Gag蛋白在体外表达系统中可自行组装成100120nm的VLPs(GagVLPs),并靶向细胞膜出芽"。其中，Gag前体蛋白的，末端和P24C末端部分是形成VLPs的最基本条件，而在其C末端融合表达外源蛋白不会影响VLPs的组装。因此，目前HIVVLPs疫苗均是基于GagVLPs技术呈递HIV其他的抗原(如Env、Pol蛋白)或表位(如V3)，来诱导

15、针对VLPs组分的免疫反应WE。如利用Gag蛋白基因与Pol蛋白基因进行融合表达后形成的VLPs可成功诱导针对两种蛋白的CD8T细胞免疫I叫此外，将HIV-1Env的V3表位基因融合到Gag的C末端，表达形成的嵌合VLPs能诱导有效的针对HIV-1的免疫反应®。研究证实，将Gag蛋白和Env蛋白进行融合表达能增强Env蛋白在VLPs表面上的稳定性，且不会干扰VLPs的组装Sr。匚有研究表明，利用HIVVLPs来构建多蛋白和多亚型的嵌合VLPs是一种有效的策略，如将表达HIV-1B型Gag蛋白和A型的Env蛋白形成的嵌合VLPs免疫小鼠后，能诱导HIV.1特异的CD4和CD8T细胞反应

16、，以及交叉中和抗体。同时，利用HIVGagVLPs来表达特定的HIV相关表位如V3.或者HIV的包膜蛋白Envgp!40或gp41形成的嵌合VLPs疫苗的临床前动物试验也正在进行中®。2.3.2 登革病毒(denguevirus.DENV)VLPs疫苗：DEN属于黄病毒科，黄病毒属，是引发登革热(DF)和登革出血热(DHF)的病原体，迄今为止，国内外尚无有效疫苗来预防。由于DENV含四个血清型(DENV1-4),各血清型之间缺乏交叉保护，因此四价DENVVLPs疫苗是登革疫苗研究的方向oSugrue等E最早利用甲醇酵母表达系统表达DENV1包膜蛋白prM和E基因，获得了直径为30nm

17、的DENVVLPs,免疫兔后可诱导中和抗体的产生，但该表达系统受到甲醇的严格调控，且VLPs产最低。Konishi等肉尝试利用哺乳动物细胞表达系统制备dewVLPs,发现表达产物会诱导细胞产生融合和凋亡。刘文权等，33-s通过将denV2prME基因克隆到毕赤酵母组成型表达启动子GAP下游，并引入DENV信号肽，成功实现TDENVVLPs在酵母中的高水平表达，并被有效分泌到上清中，克服TDENVVLPs产量低的瓶颈。目前DENV1-4型VLPs均利用该表达系统获得了成功表达，为四价DENVVLPs疫苗的制备奠定了基础。3嵌合VLP疫苗VLPs的另一个重要应用就是将VLPs作为载体，通过基因融合

18、表达或化学偶联的方法将外源抗原多肽与其形成嵌合VLPs*。由于该嵌合VLPs融合了抗原多肽和VLPs的免疫优势，利用VLP能被DCs有效摄取的特点，将携带的抗原多肽有效地呈递给免疫效应细胞，从而达到增强机体免疫的效果。迄今为止，已有包括HBcAg、HPVL1和噬菌体QB等自组装的VLPs被广泛应用于嵌合疫苗的构建皿-把。一些嵌合VLPs疫苗已经进入临床试验阶段：如融合A型流感病毒M2的HBcAg嵌合VLPs疫苗，疟疾嵌合VLPs疫苗等心叽此外,利用VLPs携带肿瘤侍异性抗原制备的治疗型疫苗也是目前研究的热点"利。4讨论和展望VLPs具有比可溶性重组蛋白更强的免疫原性，同时比活减毒疫苗

19、和病毒载体疫苗更安全；因此，基于'IPs平台来开发预防性和治疗性疫苗无疑将是最有效的一种疫苗策略。虽然VLPs疫苗的研究依旧面临诸多瓶领，如表达系统的选择、VLPs组装效率的提高以及病毒变异带来的免疫逃避等。然而，随着植物表达系统作为生物反应器的日渐成熟，以及VLPs良好的结构稳定性及可塑性，基于VLPs构建多价或嵌合疫苗将具有广阔的应用前景。同时，利用VLPs可包褒大分子物质的特性，将其作为纳米载体来传递药物和DNA片段将为未来VLPs在生物医学和材料科学上的应用开辟一个新的方向。参考文献：(11NoadR.RoyP.Virus-likeparticlesasimmunogensJ.

20、TRENDSinMicrobiology,2003,11(9):438-443.2 JohnsonJE,ChiuW.Structuresofvirusandvirus-likcparticles。.CurrOpinStructBiol,2000.10(2):229-235.3 PatientR,HouriouxC,RoingeardP.MorphogenesisofhepatitisBvirusanditssubviraienvelopeparticlesJ.CeilMicrobiol,2009,11(11):1561-1570.4 GrgacicEV.AndersonDA.Virus-lik

21、eparticles:passporttoimmunerecognition).Methods,2006,40(1):60-65.5 LacasseP.DenisJ.LapointeR,etal.NovelplantvirusbasedvaccineinducesprotectivecytotoxicT-lymphocyte-mediatedantiviralimmunitythroughdendriticcellmaturation.JVirol,2008,82(2):785-794.6 SistiguA,BracciL.VaJentiniM,ctal.StrongCD8*Tcellanti

22、genicityandimmunogenicityoflargeforeignproteinsincorporatedinHIV-1VLPsabletoinduceaNef-dependentaedvation/maturationofdendriticcellsJ.Vaccine,2011,29(18):3465-3475.7 BuonaguroL,TagliamonieM.TomescBoML,etal.Developmentsinvirus-likeparticle-basedvaccinesforinfectiousdiseasesandcanccrJ|.ExpertRevVaccin

23、es,20H,10(11):1569-1583.8 CassidyA.MossmanS,OlivieriA.etal.HepatitisBvaccineeffectivenessinthefaceofglobalHBVgenotypediversityUJ.ExpertRevVaccines,2011.10(12):1709-1715.(9jYangXY,BoH.ShuYL.HepatitisBviruscoreantigenasacarrierforvjrus-likcparticalvaccine:areviewJJ.BingDuXueBao,2012,28(3):311-316.f10S

24、chillerJT.CastellsagueX,VillaLL,etal.AnupdateofprophylactichumanpapillomavirusLIvirus-likeparticlevaccineclinicaltrialresults(J|.Vaccine,2008,26(Suppl10):K53-61.11SchellcnbacherC,RodenR.KirnbauerR.ChimericLI-L2virus-!ikcparticlesaspotentialbroad-spectrumhumanpapillomavirusvaccines。.JVirol,2009,83(19

25、):10085-10095.12|HillmanRJ,GiulianoAR,PalefskyJM,etal.Immunogenicityofthequadrivalenthumanpapillomavirus(type6/11/16/18)vaccineinmales16to26yearsoldJ.ClinVaccineImmunol,2012,19(2):261-267.13CaidciraJdoC,MedfordA,KinesRC,etal.Immunogenicdisplayofdiversepeptides,includingabroadlycross-typeneutralizing

26、humanpapillomavirusL2epitope,onviruslikeparticlesoftheRNAbacteriophagePP7J.Vaccine.2010,28(27):4384-4393.14JHerbst-KralovetzM,MasonHS,ChenQ.Norwalkviruslikeparticlesasvaccines(J).ExpertRevVaccines,2010,9(3):299-307.15 SantiL,BatchelorL,Huang乙etal.Anefficientplantviralexpressionsystemgeneratingorally

27、immunogenicNorwalkvirus-likeparticlesP).Vaccine,2008,26(15):1846-1854.16 VelasquezLS,ShiraS,BertaAN,etal.Intranasaldeliver-ofNorwalkvirus-likeparticlesformulatedinaninsitugelling,drypowdervaccineJJ.Vaccine,2011.29(32):5221-5231.17 LathamT,GalarzaJM.Formationofwild-typeandchimericintluenzuvirus-likep

28、articlesfollowingsimultuneousexpressionofonlyfourslructurulproieins|J|.JVirol,2001.75(13):6154-6165.118|PushkoP.TumpeyTM.BuF.ctal.Influenzavirus-likcparticlescomprisedoftheHA.NA.andMIproteinsofH9N2inlluenzavirusinduceprotectiveimmuneresponsesinBALB/cmice(J.Vaccine.2(X)5.23(50):5751-5759119)BrightRA.

29、CarterDM.DanilukS.etal.Inlluenzavirus-likepanicleselicitbroaderimmuneresponsesthanwholevirioninactivatedinfluenzavirusorrecombinanthemagglutinin|J.Vaccine.2(X)7.25(19):3871-3878.20PushkoP.KortT,NathanM.etal.RecombinantMINIvirus-likeparticlevaccineelicitsprotectiveimmunityinferretsaguinstihe2(X)9pand

30、emicHINIinlluenzavirus|J|.Vaccine,2010.28(30):4771-4776.|211TaoP.LuoM.ZhuI),clal.Virus-likeparticlevaccinecomprisedoftheHA.NA.andM1proteinsofanavianisolatedH5NIinfluenzavirusinducesprotectiveimmunityagainsthomologousandheterologousstrainsinmice|J|.ViralImmunol,2(X)9.22(4):273-281.|22PushkoP.TumpeyTM

31、,VanHoevenN.elal.Evaluationofinlluenzaxirus-likeparticlesandNovasomeadjuvantascandidatevaccineforavianinfluenzalJ|.Vaccine.2007.25(21):4283-4290.23KangSM.PushkoP.BrightRA.etal.Influenzavirus-likepurticlesuspandemicvaccines|J|.CurrTopMicrobiolImmunol.2(X)9.333:269-289.1241ZhaoW.LiaoGY.JiangYJ.ctal.Ex

32、pressionandselfassemblyofHCVstructuralproteinsintovirus-likeparticlesandtheirimmunogenicityJChinMedJ(Engl),2004,117(8):1217-1222.|25|ElmowalidGA.QiaoM.JeongSH.etul.ImmunizationwithhepatitisCvirus-likeparticlesresultsincontrolofhepatitisCvirusinfectioninchimpanzecs|J|.ProcNatlAcadSci.2007,104(20):842

33、7-8432.|26|GarroneP.FluckigerAC.MangeotPE,etul.Aprime-booststrategyusingvirus-likepaniclespseudotypedforHCVproteinstriggersbroadlyneutralizingantibodiesinmacaquesJ.SciTranslMed.2011.3(94):94ra71.|27JalaguicrP.TurcotlcK,DanyloA.ctal.EfficicmproductionofHIV-1virus-likcparticlesfromamammalianexpressionvectorrequirestheN-ierminalcapsiddomain|J|.PLoSOne.2011.6(ll):e28314.|28|TagliainonteM.ViscianoML.TorneselloML.etal.HIV-GagVLPspresentingtrimericHIV-Igp!40spikesconstitutivelyexpressedinstabledoubleiransfeclcdinsectcellline|J|.Vaccine,2011.29(31):4913-4922.129 Doan