纳米佐剂在疫苗研究中的应用.docxVIP

1、,综述.纳米佐剂在疫苗研究中的应用侯永利综述；吴晓此，胡四海审校南华大学病原生物学研究所，湖南衡阳421001摘要:纳米佐剂(nanoparticle-basedadjuvants)是指粒径1000nm的佐剂。与传统佐剂相比，纳米佐剂因具有靶向性、缓释性、安全性及高效性等优点而受到疫苗研究者的青睐。特别是其在免疫辅佐效果和安全性方而表现出极大的优势,促进了许多新型疫苗在临床上的广泛应用。同时，纳米佐剂可提高基因转染效率，这一特征为核酸疫苗的应用提供r可能。现从纳米佐剂的组成成分、作用机制、免疫辅佐效果以及临床应用等方而对几种极具潜力的纳米佐剂作一概述。关键词:纳米佐剂;作用机制;辅佐效果;疫苗

2、中图分类号：R979.5文献标志码：A文章编号：1005-5673(2018)05-0080-06DOI：10.13309/ki.pmi.2018.05.014ApplicationsofNanoparticle-BasedAdjuvantsonthevaccineHOUYong-li,WUXiao-xia,HUSi-haiInstitutionofPathogenicBiolo,MedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyeng421(X)1,HunanProvince,ChinaCorrespondingauthor:HUSi-hai,E-mail

3、:hh$hh_518Abstract:Nanoscale-basedadjuvantisanadjuvantwithaparticlesizelessthan1(XX)nm.Nanoparticle-bascdadjuvantshavebeenahotspotbecauseofitstargeting,delayedreleasing,safetyandeffectivenesscomparedwithconventionaladjuvants；especiallyfor,theimtnuncadjuvanteffectandsafetydominanceshavepromotedthenew

4、vaccinestobeusedwidely.Additionally,nanoparticle-basedadjuvantscanincreasetheefficiencyofgenetransfectionforaDNAvaccine.Here,webrieflyreviewtheresearchconceniingthecomponents,mechanisms,immuneadjuvanteffectsandclinicalapplicationsofnanoslructure-bas>edadjuvants.Keywords:Nanoparticle-basedadjuvant

5、s；Mechanism；Help-effect；Vaccine近年来，随着基因工程技术和分子免疫学研究的不断发展，多种新型疫苗相继研发成功，如重组蛋白疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，为疫苗领域注入了新的活力，而与传统的全菌疫苗相比，其免疫原性较弱，不足以刺激机体产生有效的免疫应答，通常需要使用适当的佐剂来增强其免疫原性，以达到理想的免疫效果。传统铝佐剂是一种将抗原吸附于内部,使其成为一个巨大的“抗原储存库”，通过局部注射进入人体后，充分发挥抗原缓释作用,辅助抗原诱导产生持续的免疫反应。铝盐佐剂是首先被美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准基金项

6、目：国家fl然科学基金(81172890)作者简介:侯永利(I993-),女，镇土研究生，主要从事H群流脑疫苗研究工作。通信作者：胡四海.教授.E-mail：hhsshh一518用于人类的疫苗佐剂。近20年来,多种新型佐剂被发现用于疫苗研究，它们在增强体液免疫和细胞免疫应答等方面与铝佐剂相当或更加有效6】，其中，纳米技术在佐剂中的应用为疫苗研究提供了更多的新思路。纳米技术的概念由美国物理学家RICHARDFEYNMAN在1959年首次提出，意味着在分子水平上对单个原子进行修饰与调整。纳米佐剂是指粒径在1000nm以内，可以增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的纳米粒子。现从纳米佐剂的特性

7、以及无机纳米佐剂，生物分子纳米佐剂，新型纳米佐剂的蛆成成分、作用机制、免疫辅佐效果、局限性以及临床应用等方面对儿种目前具有较大发展潜力的纳米佐剂作概述。1纳米佐剂的特性纳米佐剂具有提高疫苗抗原稳定性、免疫原性以及缓释性的特点，同时纳米佐剂表面丰富的活化中心可以使其与抗原稳定结合，作为高效的运载工具将抗原进行靶向运输。纳米佐剂可以通过封装包赛、被动吸收或基因融合等方式装载抗原，从而为抗原形成一个“仓库”以防止酶解或水解，将抗原以完整的形式运送到淋巴细胞或者抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC),促进抗原的提呈以及产生持久且高效的记忆性免疫应答。与此同时，一些纳米佐剂还

8、具有免疫刺激作用，可以通过提高APC的提呈效率从而增强免疫应答。研究发现,粒径是影响疫苗在体内运输和被APC摄取的重要因素。粒径1000nm的纳米粒子容易被树突细胞和巨噬细胞摄取，而粒径100nm的粒子则更容易通过淋巴管输送而与APC接触。实验证实,纳米佐剂能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫，并且能够延缓抗原的释放速度，从而持续刺激机体产生高滴度的抗体。因此，纳米佐剂越来越受到疫苗研究者的青睐。2无机纳米佐剂纳米磷酸钙佐剂纳米磷酸钙佐剂(calciumphosphatenanoparticles)是通过共沉淀以及反向微乳液的方法制备而成的粒径1000nm的纳米颗粒，具有良好的生物相容性及安全性，

9、nJ以作为一种有效的运载工具将外源基因转运到细胞内进行抗原识别。19世纪，磷酸钙纳米颗粒由RELYVELD教授在法国巴斯德研究所首次研制。将纳米磷酸钙包裹疱疹病毒蛋白后免疫小鼠，发现其可刺激小鼠产生较高的抗原特异性细胞免疫和体液免疫应答，同时未见明显的不良反应，对小鼠有较理想的保护作用。目前，多家公司研发了纳米磷酸钙佐剂，有些已实现了商品化。其中美国BioSante制药公司对其生产的纳米磷酸钙佐剂Biovant©做fI期临床试验，旨在确定Biovant®是否能提高机体对H5N1禽流感病毒抗原的免疫效应。KIVERA等研究发现,Biovant©能刺激机体产生高滴度的

10、抗H5N1特异性抗体，效果与相佐剂相当，且无明显的安全性问题。与此同时,PEDRAZA等研究表明，合成粒径约为700nm的磷酸钙纳米颗粒，通过细胞毒性试验评价其安全性，并利用荧光显微镜和流式细胞仪对其基因转染能力进行评价，结果表明该磷酸钙纳米颗粒可显著提高基因转染效率，提示纳米磷酸钙佐剂具有成为DNA疫苗载体或佐剂的潜能。目前，多种以纳米磷酸钙作为佐剂的疫苗正在研制之中，包括HBV、HSV-2、流感疫苗等n”。但是采用磷酸钙纳米颗粒进行基因转染时，有可能会导致外源基因整合入宿主基因组从而降低疫苗安全性。2.1 纳米铝佐剂纳米氢氧化铝佐剂(aluminumhydroxidenanoparticl

11、es)是由较小的纤维粒了聚集而成的大小约为4.5nmx2.2nmx10nm的颗粒，它是在传统铝佐剂的基础上进行分子改构后形成的纳米佐剂。铝佐剂是FDA首先批准使用的人用疫苗佐剂,但其作用主要是增强体液免疫应答，对细胞免疫的辅助效果不明显，只适用于作为具有强免疫原性或可大量生产的疫苗抗原佐剂'。目前,多家研究机构正在积极研发纳米铝佐剂，并已取得可喜的成绩。SUN等:通过水热合成的方法制成纳米铝佐剂，粒径约为100nm,并进一步控制反应条件获得了不同形貌的纳米铝颗粒。研究发现，将纳米铝佐剂制备成棒状结构，能更好发挥纳米铝的佐剂效应，这为纳米铝佐剂在物理性状上的研究奠定了良好基础。LI等用含

12、纳米铝佐剂与常规铝佐剂的疫苗分别免疫小鼠,40d后取小鼠注射部位组织进行观察。结果显示，与常规铝佐剂相比，纳米铝佐剂免疫小鼠的注射部位无明显炎症反应，说明纳米铝佐剂与常规铝佐剂相比具有更好的安全性。将铝佐剂纳米化，可极大地增大佐剂表面积，从而增加抗原吸附率。更令人惊喜的是,SUN等研究发现,与传统铝佐剂相比，纳米铝佐剂免疫的小鼠肿瘤尺寸明显减小,这表明纳米铝佐剂可以提高肿瘤细胞疫苗(tumorcellvaccinetTCV)的抗痛效果。但纳米铝佐剂有时可能在注射部位上会引起轻微的炎症反应，这与其具有免疫刺激效应，可以通过活化炎症小体来诱导产生IL-lg、IL-18等有关。3生物分子纳米佐剂3.

13、1脂质体脂质体(liposomes)是由一层或多层双分子膜包封而成的空心小泡结构，兼具佐剂和载体功能。它可促进APC对抗原的摄入，从而增强免疫效应。1965年,BANGHAM等(邮首次发现了脂质体。研究人员合成了双层间交联的多层脂质体载体结构。利用该载体包裹抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)后免疫小鼠，检测发现其可显著提高机体的体液免疫和细胞免疫水平，且血液中近30%的CD8T细胞发生了快速增殖。专门从事药物传递系统开发的ALZA公司开发研制了长循环脂质体，其粒径约为150nm,该技术被成功应用于阿霉素脂质体注射液Doxil©中。Doxil®于1995年在美国上市，

14、并已取得了治疗乳腺癌、卵巢癌、骨翰瘤等多种临床适应症许可'闾。近年来，默克公司研制的BLP25脂质体疫苗Stinwvax®受关注，其作用原理为激活人体免疫系统，使之靶向作用于表达肿瘤抗原MUC-1的肿瘤细胞。临床II期研究显示,Stimuvax©能产生较强的免疫攻击效果，并旦在长期治疗中耐受性良好,无剂量限制性毒性。遗憾的是，该疫苗在临床III期研究中遭遇失败，被迫停止研究【。该研究表明如果肿瘤疫苗没有特异性的靶标，单靠佐剂产生的免疫攻击作用，对于肿瘤治疗来说是远远不撕的。利用脂质体作为免疫佐剂具有其他佐剂无可比拟的优势:脂质体作为载体具有与铝佐剂相似的免疫效果;脂

15、质体载体主要成分为脂类,易于被机体生物降解，能显著降低注射部位出现炎症反应的概率;脂质体作为载体可包裹大量的抗原，具有极强的储存库效应然而，脂质体作为佐剂仍有某些尚未解决的难题,如在包裹抗原过程中，小的脂质体倾向于融合成大脂质体以形成稳定状态，而在脂质体相互融合过程中，易造成其内包裹抗原的丢失，从而影响免疫效果】。总体来说，脂质体作为载体为疫苗的发展提供了新的思路，但脂质体佐剂的稳定性仍是研究工作的-大瓶颈，其能否顺利用于人类疫苗还需更深入的探索和研究。3.2 类病毒体类病毒体(virosomes)由圆形单层小囊构成，是一种不含病毒核酸的空壳结构，直径约为150mn。类病毒体抗原释放系统是在脂

16、质体的基础上发展的一种更高级的抗原输送系统。一般认为，类病毒体保留了天然病班颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原去位,不但能激发体液免疫，而旦还可以激发细胞免疫和黏膜免疫.在没有任何佐剂的情况下仍可诱导较强的免疫应答。最具代表性的类病毒体疫苗为甲肝疫苗Epaxal©,2003年在尼加拉瓜进行的临床试验证明，单剂的Epaxal©能有效地控制甲肝的暴发和流行】。一项有6000多位受试者参加的临床试验显示，分别接种Epaxal©和铝佐剂疫苗后，受试者中出现注射部位疼痛的概率分别为24%和65%w。这说明与铝佐剂相比，类病毒体疫苗具有更高的安全性。类病毒体佐剂可模拟自然感染

17、，诱导产生高水平的免疫应答;并且能够在体内完全生物降解，减少了外源性物质在机体内的残留，故而更安全、高效。类病毒体属于微生物，在敏感的宿主休内可能会进行自我复制，引起宿主表现出一些感染的症状。因此,对类病毒进行基因修饰可以降低或者阻止其在宿主体内的复制。3.3病毒样颗粒病毒样颗粒(virus-likeparticles)是由一种或几种结构蛋白自组装形成的直径在20200nin的空壳结构。20200nm的病毒样颗粒易通过直径约为200nm的淋巴管扩散进入淋巴系统，与免疫细胞广泛接触。由于病毒样颗粒不含核酸物质，所以不具备感染性，且在体内无法进行复制。病毒样颗粒与天然的病毒结构相似，大多数的病毒样

18、颗粒具有二十面体立体对称结构或螺旋结构。由于其天然的病毒样结构，使得病毒样颗粒易于结合在MHCI类分子和MHCII类分子表面，从而被APC所识别,刺激机体产生高水平的体液免疫以及细胞免疫应答。此外，病毒样颗粒的多价性使得B细胞识别特异性抗原的受体可以有效的交联以及活化2妇。通常来说，病毒样颗粒的引流主要包括两个步骤:首先，通过组织内皮表面的空隙扩散进入淋巴系统;其次，被动转运进入淋巴结中的淋巴成纤维细胞2病毒样颗粒作为疫苗运载平台可以通过化学或者基因融合的方法将外源基因展示在其表面,成为嵌合病毒样颗粒;该颗粒由于其结构的优势，在没有任何佐剂的作用下可以诱导强烈的免疫应答。RIEDL等商研究发现

19、，将乙肝核心蛋白通过微蜡RNA结合在病毒样颗粒C端富含精氨酸区域;制备出乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒，将其刺激未经免疫的小鼠脾细胞以及树突细胞时，可诱发产生Thl型免疫反应，可以分别产生高水平的IFN-y及IL-12p70,来刺激活化T细胞的增殖以及诱导细胞毒性T细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)和自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)的细胞毒性。KAWANO等S利用嵌合SV40病毒样颗粒免疫经HLA-A02：0】转染后的小鼠,SV40病毒样颗粒在体外通过上调成熟标志物CD80、CD40和CD86来促进树突细胞的成熟、分化，因而可以在没有佐剂的情况下，有效地

20、诱导产生特异性细胞毒性反应及保护性免疫对抗流感A病毒。Y1N等叫研究发现，在以乙肝病毒核心蛋由为载体制备新型炭疽表位疫苗的动物免疫试验中，以病毒样颗粒为载体的嵌合蛋白免疫组(不加铝佐剂)诱导的抗体效价，与疫苗蛋白添加铝佐剂组一样高。病毒样颗粒由于其自身的大小以及结构优势，可以作为一种高效且安全的疫苗递送系统，同时其本身也有佐剂效应，可以辅佐外源性抗原产生更有效的免疫应答。然而，病毒样颗粒的局限性在于其本身要装载的外源基因的序列长度，外源基因所含氨基酸数量超过300时则会影响病毒样颗粒自组装成颗粒样结构，这就导致病毒样颗粒的表面效应的缺失以及相关免疫刺激效应减弱。所以，提高病毒样颗粒装载外源基因

21、的效率是其成为通用高效的疫苗载体的必备条件。4新型纳米佐剂4.1免疫刺激复合物免疫刺激复合物(immunostimulatingcomplexes,ISCOMs)是一种将抗原、胆固醇及植物皂昔QuilA以1：1：1的比例混合形成的复合型佐剂,是一种全新的抗原递呈系统，具有佐剂和抗原的双重功能1984年，MOREIN等*出首次报道了ISCOMs的佐剂功能，并预言其有可能成为亚单位疫苗的佐剂，这一发现在疫苗研究领域引起了高度的重视。在ISCOMs基质中，植物皂昔QuilA与固醇类或磷脂酰胆碱结合,形成稳定的网状结构，直径约为40nmo临床试验结果显示.ISCOMs可以在免疫机体后迅速有效地诱导T细

22、胞应答，尤其是Thl细胞应答，具有较高的免疫活性；同时，其可增强APC对抗原的递呈，并具有刺激天然免疫系统产生IL-12的能力如迂。近年来jsCOMs逐渐被应用于HIV、HSV、HCV和癌症疫苗的临床试验之中，均获得了良好的免疫效果建】。诱导黏膜免疫应答是预防经黏膜途径感染病原体的有效措施。霍乱肠毒素B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位是目前已知最好的能够黏膜用药的非复制性黏膜佐剂，但这两种黏膜佐剂因具有较大的毒性而应用受限。研究显示，含ISCOMs的疫苗可通过口服或鼻腔接种的方式进行免疫，可在局部和全身黏膜表面诱导产生特异、有效的黏膜免疫应答M。表明ISCOMs是一种有效且安全的黏膜免疫佐

23、剂，可能会为黏膜疫苗的发展带来希望。20世纪末,ISCOMs被进-步制备成QS-21佐剂来制备口蹄疫疫苗，该佐剂极大提高了疫苗的安全性需要指出的是，ISCOMs并不能与所有的目的抗原形成免疫复合物，它只能与含有较多疏水基团的免疫原结合，而含较多亲水基团的免疫原并不适合与ISCOMs混合制备疫苗°MF59MF59是一种水包油型乳剂，由鲨烯(4.3%)、Tween80(0.5%)和山梨糖醇三油酸酯Span85(0.5%)在高压条件下微流化而成，其平均粒径v250nmoLOFANO等或研究表明,MF59能在注射部位形成局部免疫微环境，激活小鼠局部免疫细胞。同时，MF59可特异性诱导单核细胞

24、分化为成熟的树突细胞，从而高效地摄取、递呈抗原。前期临床研究显示，以MF59作为佐剂可以大幅度减少抗原的使用剂量，并且在免疫机体之后诱导产生持续的体液免疫应答】。临床毒理学研究表明，MF59无遗传毒性、致畸或致敏等与治疗相关的安全性问题，只有极少数志愿者出现了局限在注射部位的炎症反应5)。1992年，由Novartis公司研发,以MF59作为佐剂的季节性流感疫苗FLUAD©进行的临床前试验显示，其免疫效果显著39101997年，该疫苗在意大利获得使用批准。之后的20多年，在美国和多个国家进行的多中心临床试验评估了Flu-ad©的免疫原性和安全性，显示该疫苗能诱导较高的抗体水

25、平，同时没有检疣出与MF59佐剂相关的安全性问题°2014年，以MF59为佐剂的流感疫苗FLUAD©获得FDA使用批准正式上市叫。5展望目前,疫苗是对抗及预防疾病的有效手段，对于不同的病原体则需要新型且可以有效诱导机体产生适应性免疫的措施，而纳米技术的引入开创了疫苗研发的新思路。纳米佐剂作为抗原运载工具以及免疫刺激物.将疫苗抗原通过不同途径在体内诱导适应性免疫和固有免疫，从而提高疫苗的免疫保护性】，旦已应用于多种疫苗研发中，在多种动物模型实验中表现出安全性、缓释性和高效免疫辅佐性等诸多优势。与此同时，纳米佐剂具有合适的形状以及大小，使其更为容易地进入引流淋巴结，从而有效地被

26、APC识别并提呈诱导特异性免疫反应-如。此外，由于疏水性的纳米佐剂比亲水性的纳米佐剂可以诱导更加高效的免疫反应，因此，可以通过物理以及化学方法来优化亲水性纳米佐剂结构,从而提高抗原装载率使其更好的发挥佐剂效应。随着疫苗学的进一步发展以及针对纳米佐剂作用机制的深入研究，将会有更多的纳米佐剂被发现并用于人类和动物疫苗之中。参考文献MATHAESR,WINTERG,SJAHAANTJ,elal.Influenceofparticlesize,anelongatedparticlegeometry,andadjuvantsondendriticcellactivationfJ.EurJPham)Bio

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