禽用减毒沙门菌活载体疫苗的研究进展.docx

1、文缺综述国用腿雷涉门扇活裁伽哽苗的研拜迅展*II朱麟'，王红宁2（1.四川农业大学动物科技学院，四川雅安625014；2.四川大学生命科学学院，四川大学动物疾病防控生物工程研究中心，四川成都610064）疫苗主要通过激发机体的免疫系统来达到防治疾病的目的。目前，疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗及基因工程疫苗等。基因工程疫苗包括基因缺失苗、基因重组苗等。活载体疫苗是将胞内感染性的细菌直接用来运载目的基因进入体内，而产生相应的免疫应答反应。目前沙门菌的预防与治疗通常使用药物"但沙门疫苗研究正退速发展，如减毒沙门萌活载体疫苗则是将减毒后的沙门菌作为载体，运载编码抗原的基因进入体内，激发

2、免疫反应。很多实验证明，减毒菌能对与活载体相关细菌产生免疫保护力，又能对插入基因相关疾病产生保护力，有效激发机体产生免疫应答，同时不会对该细菌的生存与繁殖产生影响3气减毒沙门菌可侵入到宿主的Peyer集结、肠淋巴结、肝、脾等组织细胞，表达异源抗原，不仅激发出宿主针对沙门菌本身的免疫反应，而且激发出针对其所携带抗原的各种免疫反应，包括局部体液免疫、全身体液免疫和细胞免疫反应，尤其是CTL作用，而减毒沙门曲本身可以起到免疫佐剂的作用。由于已减毒，最终可被宿主清除。减毒沙门菌作为载体运送目的基因进入体内，诱导机体产生黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答。在这一过程中既能保证载体疫苗的安全性，又能以诱导保

3、护性免疫应答的方式表达外源抗原。减毒沙门菌活载体疫苗可以携带较大的基因片段，易于构建多价疫苗，具有联合免疫和免疫佐剂的作用，所表达的靶抗原不需要提纯，能激起持久的系统和黏膜免疫反应，同时，还具有诱导作用位点比较明确、制备简单、安全性好、批最生产成本低、接种简单方便等优点，2成为疫苗领域的研究热点。近年来有实验表明，减毒沙门菌可将克隆有异源抗原基因的真核表达质粒携带并释放入宿主深部淋巴细胞，使异源抗原基因在淋巴细胞的真核环境中进行表达。因此，减毒沙门菌既可作为针对同源抗原的活疫苗，也可作为诱导针对其他病原微生物产生保护性反应的载体。减毒沙门菌载体的构建策略是使致病基因缺失，然后将外源基因整合到沙

4、门菌染色体的特定部位，这样沙门菌就可以稳定表达外源基因。异源抗原的表达目前主要采用带抗性的质粒载体进行表达、利用染色体整合系统或构建平衡致死系统3种方法。沙门菌减毒株多为生物合成途径缺陷或调节表达系统缺陷的突变株，如aro、phoP或bQ突变株。这些菌株可以模拟自然感染但不引发疾病，并有很好的耐受性和免疫原性,这就有助于我们构建减毒沙门菌活载体疫苗，呈递外源抗原，预防各种病原体引起的疾病气1国内外研究进展随着分子生物学的应用和对沙门菌致病机制的进一步了解，人们能够识别病原体在宿主体内生存和致病的一些必需基因，这些基因的缺损在遗传上是稳定的，因此可以通过基因工程的手段使沙门菌达到的效果。1987

5、年Curtiss等构建了cya.crp双基因突变株，因该菌缺失基因，不能合成cAMP受体蛋白，乂缺失cya基因，亦不能从宿主体内摄取cAMP以供己用，所以它在宿主体内返强的可能性很小。Curtiss研究组在1994年发展了一种asd/asd-平衡致死体系。该系统沙门萌染色体上md基因的缺失突变由质粒载体携带的以#来弥补。已将5上引入其他如aroycya、crp减毒株中用来表达肺炎球菌表面蛋白A(PspA)并有保护作用。wd基因编码天冬氨酸B2半醛脱氢酶，突变后细菌的生长需要二氛基庚二酸(DAP)以合成细胞壁，而动物组织中没有DAP,所以这种平衡致死体系保证细菌进入宿主后能稳定高效表达外源抗原o

6、Cuniss等1996年基因编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，该酶催化对氨基苯甲酸和2,4-二羟基苯甲酸盐的分支酸途径的中间反应，产生芳香族氨基酸皿。当耐。A基因缺失，该菌在无此合成途径的哺乳动物体内，无法获得这些化合物，生长受到限制从而被减毒。Fagan等于1997年用鼠伤寒杆萌SL3261(q”A)减毒株表达猪肺炎支原体抗原(NrdF)蛋白回。McSorley等在1997年研究认为nirB启动子比osmC启动子效率高。利用这两类体内诱导型启动子可以稳定地在体内表达外源抗原。Guo等在1997年通过质谱仪研究发现,PhoP/PhoQ蛋白也调节脂多糖(LPS)成分之一类脂A的结构修饰，

7、从而改变LPS刺激的宿主细胞细胞因子的表达皿。HeithofF等在200()年发现pAoP基因可激活多种基因表达，而phoP蛋白或pAoP调节基因的产物可在GATC位点封闭dm的甲基化，还有人认为phoP基因调节的一个基因可能编码细菌在巨噬细胞中存活所必须的种分泌蛋白,phoP基因的突变会减弱鼠伤寒沙门菌在巨噬细胞中的存活力，Ty800、X4632、ZJ111都是缺失phoP/phoQ基因的突变株14oBumann等在2000年的研究中发现htrA突变株增强了对氧化应激的敏感性，从而削弱了它在宿主组织中生长的能力:。小鼠免疫实验证明限定型htrA突变是极好的口服疫苗。在对人有副作用的减毒株CV

8、D908中引入htrA突变后，减毒株安全且保持免疫原性。Basso等于20(X)年筛选了伤寒杆菌细胞内诱导启动子Pial、Pia2,构建了一系列表达载体在这些启动子控制下，重组沙门菌侵入真核细胞后条件性表达外源抗原。该系统已在Henle407细胞中表达百口咳毒素S1亚单位重组抗原得以验证。梁雪芽等2002年研究表明，基因编码DNA腺苜酸甲基化酶，此酶调肯的基因在其启动子或上游调节序列中都含有GATC位点，这些位点的甲基化可以控制RNA聚合酶和调节蛋白的相互作用S。此外,如基因还调节其他毒力相关基因的表达，并通过调节亮氛酸(leucine,Leu)反应调节蛋白和菌毛基因DNA序列的结合来控制菌毛

9、的表达。2003年张辉等将小d基因连接到相关质粒上导入asd突变株中，构成载体-宿主平衡致死系统，既保证了质粒的稳定又提供了细菌细胞壁合成所需的DAP,此系统因不含耐药基因被广泛的应用于临床实验中响。目前国内外学者对减毒沙门菌活载体疫苗应用方面的研究也越来越多。Hassan等于1996年研制出的MeganVacI疫苗就可以在食品安全控制方面加以应用，该疫苗是cya和erp基因突变的鼠伤寒沙门菌。家禽口服免疫MeganVacI疫苗后，可以特异性地降低沙门菌感染。用MeganVac1疫苗接种鸡，产生了特异性针对B群和D群沙门菌的体液和细胞免疫应答，显著降低了野生型菌株在鸡体内的重新定殖，而且还可以

10、对其他血清型沙门菌感染产生交又保护。种鸡群接种MeganVacI疫苗后，可产生持久的、具有保护性的母源抗体，这大大降低了沙门曲污染鸡蛋的可能性。Jain等在2001年研究发现沙门菌载体可以用于肿瘤的基因治疗，如表达IL-2,或用于运送抗肿痛治疗药物，如抗肿瘤前体药物转化酶用。由于沙门菌具有对实体瘤的自然趋向性，根据这一特性，利用鼠伤寒沙门菌VNP20009可运送药物蛋白到肿瘤部位，临床研究表明，肿瘤细胞在原位被选择性杀死。鼠伤寒沙门菌VNP20009是pwl(负责嗦吟生物合成)和眦B(负责LPS生物合成)基因缺失株，因而毒力大为降低，其对小鼠的毒力较野生型菌株大约下降了10000倍。杜爱芳等在

11、2004年将鸡柔嫩艾美耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA3-5401,高压电转化到ds和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门菌(ZJ111株)中，构建重组菌株，将其直接转染Ver。细胞，证明了减毒沙门菌能将外源基因呈递给Vero细胞并进行表达。通过鸡体内试验和体外培养表明，利用减毒沙门菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性和稳定性。张晓明等在2005年利用场/A基因突变的沙门菌能破坏含沙门菌囊泡（SCV）的特性，利用P22噬菌体转导技术将Sg基因的突变转入疫苗株SL7207,成功地构建了沙门菌SL7207Sifh突变株。该突变株可以突破SCV的束缚而进入细胞液，并有望成为理想的沙门菌疫苗

12、载体。张小荣等于2006年根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列，设计一对引物，通过RT-PCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因，测序确认后，将其克隆入其核表达载体，将重组质粒转染P815细胞，经间接免疫荧光试验证实，HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550得到运送DNA疫苗的重组沙门菌，免疫BALB/c小鼠，不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答，而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击，说明该运送DNA疫苗的减毒沙门菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒，并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。潘

13、志明等根据GenBank中发表的新城疫病毒融合蛋白（F）基因序列，设计一对引物，通过RT-PCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS-5F基因，测序确认后，将其克隆入真核表达载体pVAXl,将pVAXl-F转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,获得运送DNA疫苗的重组沙门菌X4550（pVAXl-F）。免疫CD1小鼠，可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体应答，表明该运送DNA疫苗的减毒沙门菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒，并能够刺激机体产生免疫应答李龙等用长距离RT-PCR扩增了传染性法囊病病毒ZJ2000株多聚蛋白基因，定向克隆入真核表达载体pCI,电转化dam-pho?'双突变的减毒

14、鼠伤寒沙门菌ZJ111株，并直接转染Vero细胞。RT-PCR和间接免疫荧光试验可从Vero细胞中检测到阳性信号.SDS-PAGE和West-blotting均可检测到41ku的蛋白条带。结果表明减毒沙门菌可将外源基因导入Vero细胞，并进行转录和表达，具有免疫反应性。Sadoff等将伯疟原虫环子抱子蛋白基因克隆到含有入噬菌体启动子的质粒pMG27NSTerm上，构建成重组质粒pMGB2,转化aroA突变的鼠伤寒沙门菌WR4017株，灌胃接种BALB/c小鼠，灌胃接种的小鼠没有测到特异性抗体，但是小鼠获得抵抗子抱子攻击的能力，可见灌胃接种的小鼠虽无体液介导的免疫反应，但有细胞介导的免疫反应。随

15、后的体内淋巴细胞去除试验和体外CTL作用测试显示，上述的保护作用与MHCI限制的CD&CTL作用有关。目前国内外学者已相继研制了肺炎链球菌、宋内志贺菌、结核分支杆菌、霍乱孤菌、百日咳杆菌、鼠疫耶尔森菌、牛布鲁菌、破伤风梭菌、沙眼衣原体和猪肺炎支原体、甲乙丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、伪狂犬病病毒、流感病毒、血吸虫、疟原虫以及肿瘤等疾病的重组减毒沙门菌疫苗。这些疫苗都能诱导机体产生黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答焦红梅等根据GenBank公开序列设计一对引物，通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长S1基因，并将其插入真和表达质粒pVAXl中，构建真核表达质粒pVAXl-

16、Sl,再将重组质粒转染COS-7细胞，采用间接免疫荧光检测出S1蛋白的外源表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中，接种小鼠，结果显示重组萌对小鼠有良好的安全性，并能检测到针对S1蛋白的特异性血清抗体:&。2存在问题应用活载体疫苗也存在一定的局限性：第一，重组表型的稳定性，采用细菌菌株作为异源抗原的疫苗载体，质粒的应用常常引起重组表型的不稳定性，载体的竞争力、可重复性和效力都得不到保证。另外，在非限制状态下菌株的传递存在抗生素抗性标志。第二，先存的免疫力，如果已对载体菌株有免疫力，则将显著削弱所诱导的对异源抗原的免疫应答。第三，宿主遗传因素，宿主遗传因素可以调控由活菌载体本身

17、或其表达的疫苗抗原刺激的免疫应答。3展望减毒沙门菌不仅可以预防沙门菌的感染，而且还可以作为异源抗原的载体，构建表达其他病原体保护性抗原的活疫苗，通过口服和黏膜免疫获得相应局部免疫、体液免疫和细胞免疫应答。这种活载体疫苗不仅使用方便，而且成本低廉，尤其适用于规模化养殖的群体免疫，在疫苗制备过程中避免向环境散毒的危险。但其存在的一些局限性仍有待我们进一步研究创新，为制备有效的疫苗提供理论基础，参考文献：1李郁，巍建忠.李超.等.同时感染雏格群的两种血清型沙门做的鉴定及约敏试验J.中国家禽，2008,30(4):45-46.2冯翠兰，冯国金，龙建勇，等.中草药消毒剂消推效果的初步研究UL中国家禽.2

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