禽流感血凝抑制试验(HI)的影响因素分析.docx

1、禽流感血凝抑制试验（HI）的影响IIIII因素分析刘俊青（山西省长治市郊区畜牧兽医局，山西长治（）46000）中图分类号:S858.3文献标志码：B文章编号：1008-04i4（2014）08-0010-03摘要血彼抑制试股是检测禽沈感抗体水平的一种常用方法，具有简便、快速、灵敏、准楠、能够处理大量祥品等君点，在区县级医实睑宣被广逝应用。但是由于试验中不规范的操作和知节注意不够.从而导致不正确的检测姑果出现的现象时有发生，从而提供概误的冬础数据。文章粽述了减少禽流感血旅试脸的影响因素的措施。关键词血凝抑制影响因素分析患寄生虫病的病羊主要表现为消瘦、贫血、黄疽、水肿、营养不良、发育受阻和消化障碍

2、等慢性消耗性疾病的症状，结合流行病学特点和尸体剖检病变，一般可做出初步诊断。必要时可通过实验室诊断的方法，检查粪便中的虫卵和幼虫进步确诊。5.2治疗根据羊的体质、病情和寄生虫的生物学特性等进行合理用药。采取不同的方法及早进行驱虫和杀虫。要在加强护理、提高病羊抵抗力的基础上.应用各种驱虫、杀虫药物对症治疗。另外，对于某些直接接触感染的寄生虫病，还应将病寄进行隔离治疗，以免疾病扩散。6 加强对羊群的饲养管理注意饮水卫生寄生虫的感染常因水源污染引起，有些中间宿主就生存于水中。因此，不良的饮水往往是寄生虫病发生的感染源C要禁止饮用不流动的池塘、沼泽地等处的水。最好是自来水和井水，其次是干净无污染的河水

3、。6.1 保证羊只日粮的足拍:供给和饲料营养成分的全价平衡，及时补充精料，以保证发挥机体抗病能力，要防止饲料污染。6.3搞好圈舍建设、卫生、消毒。对土坏墙圈舍要搞好墙面粉刷和硬化处理，达到无缝、平整。墙高1.5-1.8m处最好用瓷片砌墙圈，防止蟠蟀扩散污染羊舍。圈舍要经常打扫.保持干燥、通风良好，光照充足、密度合理。定期应对羊舍进行消毒（至少2周1次）。6.4在寄生虫易感期应避开污染牧场放牧。6.5从外地引种的，在引种后要详细观察羊只，无病后方可混群。7 做好粪便的无害化处理患寄生虫病的羊只粪便中，常伴有很多寄生虫卵、幼虫和卵囊，如果处理不好，就会污染草料及饮水，使寄生虫病扩大传播。因此，驱虫

4、应在专门的场所进行。患寄生虫病的羊只及羊群投驱虫药后，所排粪便要及时清理、运送到指定地点进行堆积，集中收集发禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实哈（H1）。由于血凝反应可被特异性抗体所抑制，抗体与病毒结合后，血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，因此血凝抑制试脸可以用于（1）检测血清中的抗体水平；（2）卷定病毒；（3）辅助诊断病毒性疾病；（4）作为适时免疫的辅助手段，能避免免疫失败、免疫空档及重复免疫造成的损失。1 样品采集和处理1.1样品的采集环境在25Y以上时，采集的血样h以内可以自然析出血清，但环境在10Y左右时，血清很难自然

5、析出，需放置在37Y培养箱中l2h,才能析出血清“血清样品应采用随机的方法以减少人为的主观因素对最后结果产生影响，样品数址应每批采20%左右。运输全血可低温保存送检。有条件的可将自然析出或经高心分离出的收稿日期：2014-06-23酵。放牧羊群投药驱虫后7d内应禁止放牧，粪便同样也要集中发酵。发酵的目的是，利用产生的生物热，杀死寄生虫的虫卵、幼虫和虫囊。集中发怖的具体方法是：把粪便集中成堆，外用10cm泥土糊好，再用塑料膜封死，发酵灭害30d后方可开封使用。8 小结羊的寄生虫病可导致成年羊繁殖血清吸出，按需要分装到离心管中，标记清楚冷藏，同采样表一同送检.禁止运输过程中剧烈震动产生溶血现象，1

6、.2待检血清的保存当血清被细菌污染严重或长时间置于温度较高环境就会变质，变成浑浊的黄色。变质的血清往往会发生凝集反应，致使含有较高抗体的血清在做禽流感血凝抑制试验时，会出现前面几孔凝集而后面几孔凝集被抑制的现象，所以不能及时检测的血清应该放置4Y的冰箱保存。样品待检时间超过1周的需-20弋低温保存。1.3非特异性凝集素的处理在该试验中鸡血清极少出现非特异性阳性反应，没有必要在试验前对血清进行预处理。除鸡外，有些禽（如水禽、鸽子）的血清可能对鸡红细胞产生非特异性的凝集，这种特性的确定可用待检血清做血凝试验，如果待检血清也出现凝集红细胞的现象，则说明有非特异凝集素存在，需用鸡红细胞对待检血清进行吸

7、附，以除去非特异凝集索。方法：每0.5mL的血清中加入0.025mL的鸡红细胞，轻摇后静力下降，羊毛、羊乳和羊肉产量降低、品质受损，幼龄及育成羊生长发育受阻，严重影响生产效益。防控工作面广、髭大、周期K,防控不当复发率高，影响防控效果。笔者在羊的寄生虫病防控中，总结出了程序化适时驱虫、合理用药及推广羊圈舍改造等经验，这些实验要长期坚持、严格执行.才能够有效达到控制羊寄生虫病发生的目的C置至少30min,800g离心25min,收集上清液，即为处理后的血清，或者也可用被检禽中的红细胞。2胶冻样血清的原因分析在血清样品抗体检测过程中，经常出现胶冻样血清，或者完全凝结，导致不能进行检测。鸡血清析出呈

8、胶冻样的原因：（1）进食后或感染某些疾病时采血容易发生；（2）采血后放置的时间太短，血液没有完全分层就做离心处理，纤维蛋白没有析出，使血清呈胶冻状；（3）血脂高，鸡的脂肪堆积过多，在血清中的蛋白纤维和脂肪析出过多而成。饲喂高蛋白质饲料的鸡，分离的血清多呈现胶冻状。2 器材的选择和使用为使器材保持最佳工作状态，应建立选择、使用、维护器材的标准操作程序，所用器材主要有单道、多道可调微量加样器、微髭反应板、吸头、振荡器等，微量反应板、吸头尽虽使用一次性产品。3.1单道、多道可调微量加样器在使用前或使用一些时间后均应进行校正或签定。使用时需注意：（1）吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松

9、开,以防溶液吸入过快，冲入加样器内腐蚀柱塞而造成漏气；（2）为获得较高的精确度，吸头需预先吸取1次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液敏偏小而产生误差；（3）取样时只需按到第一档停点，排样时需按到第二档停点，才能彻底排出，以达到准确的取样量。2.2 微量反应板建议使用96孔90°V型一次性优质塑料反应板进行HA-HI试轮，W避免使用有机反应板因清洗不净和过度磨损而影响试验结果。若使用有机反应板，清洗程序是：试验完毕后，立即将反应板用自来水反复冲洗（以孔底不留沉积的红血球为准），再将沾有洗涤剂溶液的棉拭刷洗凹孔及板面，然后再用自来水反复冲净每个

10、凹孔及板面，待反应板干燥后，放到2%3%浓度的盐酸中浸泡24h以上.捞出后用自来水冲洗多次.最后以蒸馋水冲洗23次，在温箱中烘干备用。对底部磨损严重的反应板要及时淘汰。3.3吸头取复使用需经超声波清洗、高压天菌后使用，使用一段时间后要淘汰、及时更新。3 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）配制称7.9gNaCi,0.2gKC1.0.24gKH2PO4（或1.44gNa2HPO4）和1.8gK2HPO4,溶于800mL蒸僧水中，用HC1调节溶液的pH值至7.2,最后加蒸儒水定容至1L。分装，121弋、15min高压灭菌，一经使用，于4T保存不超过3周。4 1%红细胞悬液的配制鸡翅部脉或心脏采血。采集

11、至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的健康公鸡的抗凝血液与等量柠榇酸钠溶液混合，放入离心管中，加入34倍体积的PBS混匀，以1000r/min离心10min,去掉血浆和白细胞层，反复洗涤3次，最后吸取压积红细胞.PBS配制成体积分数为1%的悬液，于4弋保存备用。红细胞的实际数量:与新鲜程度决定了实际能与抗原结合的红细胞表面受体的数址，影响到实验的准确性，红细胞的多少影响到抗体效价的高低（正比）。5 4个血凝单位（HAU）抗原的配制先对抗原做血凝试验，以抗原与红细胞完全凝集的乱作为抗原效价，再根据抗原效价，配成4个血凝单位抗原,4个血凝单位抗原需现配现用。为保证4个血凝单位抗原的配侗准确无误

12、，须做抗原回归试验。取96孔V形微量反应板，用微址移液器在26孔每孔加25jxL的PBS,第一孔加入4HA抗原50p»L,从第一列孔吸取25jiL混匀后的抗原液加到第二孔中，混匀后吸取25皿加入到第三孔中，依次进行系列倍比稀释至第五孔.最后从第五孔各吸取25弃之。设第六孔为红细胞对照，从第一孔到第六孔依次为4HA、2HA、1HA、O5HA、Q25HA、对照每孔再加25aLPBS自右向左依次向各孔加入25jiLl%的鸡红细胞悬液。将反应板置于微量振荡器上振荡1min,室温（2025丁）静置30min后观察结果。结果判定若第一、二、三孔出现完全凝集，第四孔出现50%的凝集，则表明该4个血

13、凝单位抗原配制准确.可用于HI试验。如果第四孔也出现完全凝集，说明该血凝价提高了1个滴度，需等址稀释抗原；如果只有前2孔出现完全凝集.说明该血凝价降低了1个滴度，抗原量需加倍。6 加样在HI试验中有4次加样步骤，即加PBS、待检血清、4个血凝单位抗原、1%红细胞悬液。加样时须注意以下儿点。7.1加样时应将液体加在V型板的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。7.2注意吸头勿碰触到液面，以免发生交叉污染。7.3 倍比稀释时，避免气泡产生（吸头插入液面以F）引起混合不均，影响检测结果的准确性。7.4 1%红细胞悬液在试验过程中需随用随时摇匀，使之呈均质状态。7 孵育孵育温度对试验的影响较大，从4

14、37丁，随着温度的上.升，HA与HI的滴度也跟着升高。同时.温度的高低也影响到反应的速度，温度过低反应速度减慢，温度过高会使反应结果洗脱加快，所以孵育温度常控制在室温2025丁,湿度30%70%。此外，孵育时间也须严格控制，一般来说，以红血球对照完全沉淀的前后5min内判定试驱结果较好，在3040min。几种抗球虫药对鸡球虫的疗效对比试验陈超燕（广西壮族自治区贵港市平南县上渡镇水产畜牧兽医站，广西平南537300）文章编号：1008-0414（2014）08-0012-01中图分类号:S858.31文献标志码：B为探索使用市场上出售的几种抗球虫药对鸡球虫的防治效果，我们在晨光鸡场进行r对比性试

15、验。现将结果报告如下。1试验材料及方法球虫卵囊是从邻近鸡场收集到临床症状明显的球虫病鸡的粪便用饱和盐水漂浮再离心沉淀收集。收集到的卵囊放在平器内加入5%重络酸钾溶液使其浓度达到2.5%的情况F于温室中培养。1.1 试验鸡和分组从市场上购买问来的2（XX）羽雏鸡中，挑选出个体无明显差异的娠鸡50羽，饲养到15日龄时，逐个编号，每组10羽。1.2试验方法1.2.1把在敢络酸钾溶液卜培养的卵囊离心，除去重络酸钾，直到卵横抱子化，然后每个小鸡分别称取。第一至第四组称成后每羽喂服5万完全抱子化的卵囊。第一组小鸡在感染前一天在拌入盐霉素60mg/（kg饲料），第二组小鸡在感染前一天拌入氨内林125mg/（

16、kg饲料），第三组小鸡在感染前一天拌入氯苯脆33mg/（kg饲料），第四组小鸡作为感染对照组，第五组作为不感染对照组。饲养第一至第五组小鸡所用的饲料除了用抗球虫药成分不收褊日期：2014-04-29结果的判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为H1滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2,阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3log2判定HI试验阴性；H【同外.其它成分配比一致。1.2.2试验时间：2009年12月3H-2010年4月5Ho分别观察记录各组小鸡出病的症状、死亡情况、感染后7d逐羽称重，记录每组小鸡饲料消耗量。2试验结果与分析试验结果详

17、见表1。组科只效药物名称及其使用浪度发病数发病率死亡数死亡率相对增京率相时饲料转化率110盐客素（60）4400098.04133.25210兼丙林（120）8800053.5261.24310氯笨眼（33）66011050.6874.1341()感染不给药10100550-5.37-10.73510不感染不给药0000100100表1几种抗球虫药对对球虫的防治效果2.1发病记录感染不给药试组发病率为100%,感染试驶组的三蛆小鸡在感染后410d都有不同程度的食欲减退，羽毛蓬松闭眼呆立，拉稀粪或拉白痢等症状，盐霉素试验组的发病率为40%,氨内林为80%,氯苯服为60%。三种抗球虫药中没有一种药

18、物控制鸡球虫病的发生，但对降低发病率都有-定效果，其中以盐霉素效果最佳。2.2死亡记录感染不给药试验组死亡5只小鸡，氯苯弧组死亡1只小鸡，其他组无价等于41og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于51og2为阳性。总之，在进行愈流感血凝抑制试验时要考虑多方面的因素，尤其要注意各步骤操作的细节。只有提供真实可靠的检测数据，才能动态掌控禽群的食流感抗体水平，科学防控禽流感。死亡之现象。表明盐霉素、氨丙林在暴发球虫病时，对控制死亡都有很好的效果，而氛苯弧能降低死亡率。2.3增重记录不感染不给药组相对增重率为100%,盐霉素绢为98.04%,两组较为接近.表明60mg/（kg饲料）的盐霉素不影响鸡的生长发育，不影响鸡的增重；氨丙林和氯苯弧为53.52%和50.68%,表明两药明显影响了鸡的增重，氯苯服比氨丙林影响鸡的增重更严重“2.4相对饲料转化率记录盐霉素组为133.35%,不感染不给药组为100%。盐霉素组饲料转化率大过不感染不给药组，提高了33.35%,表明60mg/（kg饲料）的盐霉素能提高饲料转化率，氨丙林组饲料转化率降低了38.76%；氯苯胸饲料转化降低f25.87%,氨丙林降低饲料转化率比氯