四逆散、归脾汤与温胆汤对慢性应激肝郁模型大鼠行为学的影响

1、四逆散、归脾汤与温胆汤对慢性应激肝郁模型大鼠行为学的影响        【摘要】  【目的】观察疏肝方四逆散、养血健脾方归脾汤和理气化痰方温胆汤对慢性应激肝郁模型大鼠行为学的影响，以进一步探讨该模型的中医证候性质。【方法】选用SD大鼠40只，按10g/L蔗糖水摄取率分层随机分为5组，即正常对照组、模型组、四逆散组（剂量为56g·kg-1·d-1）、归脾汤组（剂量为196g·kg-1·d-1）、温胆汤组（剂量为805g·kg-1·d-1）；采用慢性

2、应激刺激方法复制肝郁证模型，观察各组大鼠体质量、血清皮质酮含量、10g/L蔗糖水摄取率和强迫游泳中静止时间。【结果】模型组大鼠血清皮质酮含量升高、蔗糖水摄取率降低、强迫游泳中静止时间延长,与正常对照组比较差异均有显著性意义（P005或P001）；四逆散组可降低血清皮质酮含量、升高蔗糖水摄取率，缩短强迫游泳中静止时间，与模型组比较差异均有显著性意义（P005或P001）；归脾汤组、温胆汤组各检测指标均无显著性改变（P005），各组大鼠体质量增加量比较均无显著性差异（P005）。【结论】本研究的慢性应激大鼠模型属肝郁证模型，与心脾两虚及痰热内扰证无关。 【关键词】  慢性应激/中药疗法；

3、肝郁证/中药疗法；四逆散/应用；归脾汤/治疗应用；温胆汤/治疗应用；疾病模型，动物；大鼠Abstract:  ObjectiveTo observe the effects of Sini Powder (SP)，Guipi Decoction (GD) and Wendan Decoction (WD)，which have the actions of soothing liver，nourishing blood and strengthening spleen，and regulating Qi and resolving phlegm respectively，on the

4、 behavior of rat models with liverQi stagnation induced by chronic stress，and to explore the essence of traditional Chinese medical syndrome of this model.MethodsForty male SpragueDawley rats were exposed to an unpredictable sequence of mild stressors for 21 days while being treated by SP (56 g·

5、;kg-1·d-1)，GD (196 g·kg-1·d-1) or WD (805 g·kg-1·d-1).According to the intake rate of 10g/L sucrose solution，the rats were divided into normal control group，model group，SP group，GD group and WD group by stratified randomization.Body weight，standing time during forced swimmin

6、g test and intake rate of 10g/L sucrose solution were investigated during the whole procedure.Serum corticosterone content was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA).Results In the model group，serum corticosterone content was increased，intake rate of sucrose solution was reduced，and st

7、anding time during forced swimming test was prolonged (P005 or P001 compared with those in the normal control group).SP counteracted the above changes in the mode group (P<005 or P<001)，but GD and WD had no effect on the above indexes (P>005).The difference of body weight increase was insig

8、nificant between the 5 groups (P005).Conclusion The rat model of liverQi stagnation can be induced by chronic stress，which is different from the syndromes of deficiency of both heart and spleen and the interior disturbance of phlegmheat.Key words:  CHRONIC STRESS/TCD therapy;STAGNATION OF LIVER

9、QI/TCD therapy;SINI POWDER /therapeutic use;GUIPI DECOCTION/therapeutic use;WENDAN DECOCTION/therapeutic use;DISEASE MODELS，ANIMAL;RATS证候是中医学研究的关键问题之一。由于影响证候的因素复杂、范围广泛以及伦等方面因素的制约，使证候发生机理的研究很难深入，建立证候动物模型是摆脱这一困境的重要途径。肝郁证是临床常见的基础性证候，已有用CCl4注射、艾叶注射或夹尾急性激怒法、模具限制法等多种制作肝郁证动物模型的报道1，但这些造模方法均因有种种缺陷，近年已很少应用。为了

10、更好地模拟临床肝郁证，我们采用慢性应激的方法初步建立了肝郁证大鼠模型2，并从临床发病学特点、核心症状和3种治法代表方剂的治疗效应等方面，分析了该模型的合理性，初步认为其证候性质属肝郁且与脾虚无关3-4。在上述工作的基础上，本研究拟比较疏肝方四逆散、养血健脾方归脾汤和理气化痰方温胆汤对该模型大鼠的行为学效应，以进一步探讨该模型的中医证候性质。现报道如下。1材料与方法11药物、试剂及仪器按照方剂学5确定方剂的组成，其中四逆散（伤寒论）：柴胡6g，枳实6g，生白芍6g，炙甘草6g；归脾汤（济生方）：白术9g，茯苓9g，黄芪12g，龙眼肉12g，炒酸枣仁12g，人参6g，木香6g，炙甘草3g，当归9g

11、，远志6g；温胆汤（三因极一病证方论）：半夏6g，竹茹6g，枳实6g，橘皮9g，炙甘草3g，茯苓45g。以上各方用饮用水将中药免煎颗粒（首创大地药业有限公司）按成人（以60kg计）1日用量的14倍配制成悬浊液，其中四逆散浓度为056g/mL，归脾汤浓度为196g/mL，温胆汤浓度为0805g/mL。蔗糖（C12H22O11，分子量为34229）购自北京化学试剂公司；皮质酮酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒（批号：24110603）购自美国R&D公司。HY2调速多用振荡器购自江苏金坛金城国胜实验仪器厂。12动物、分组及给药雄性SD大鼠40只（SPF级），体质量190210g，由北京

12、维通利华实验动物公司提供，许可证号：SCXK（京）20020003；正常光照条件，自由摄取食水，驯养1周并进行10g/L蔗糖水摄取训练。禁水24h后，于第2天清晨89时测定1h的10g/L蔗糖水摄取量，摄取率，随后采用区组随机设计的方法，按10g/L蔗糖水摄取率划分区组，再按随机数字表法随机分为5组，每组8只。正常对照组群养，每天灌胃饮用水10mL/kg；慢性应激模型组（简称模型组）孤养，每天灌胃饮用水10mL/kg，并按程序施加造模刺激；慢性应激加四逆散组（简称四逆散组）每天灌胃剂量为56g/kg的四逆散悬浊液，并按程序施加造模刺激；慢性应激加归脾汤组（简称归脾汤组）：每天灌胃剂量为196g

13、/kg的归脾汤悬浊液，并按程序施加造模刺激；慢性应激加温胆汤组（简称温胆汤组）：每天灌胃剂量为805g/kg的温胆汤悬浊液，并按程序施加造模刺激。普通饲料与饮用水在允许时可自由摄取。各组处理时间均为21d，每3d测定1次大鼠体质量，以调整灌胃药量。13造模方法2刺激方法包括：夹尾1min，水平振荡160次/min共30min，4冰水游泳5min，禁水24h，禁食24h，昼夜颠倒24h，45热环境5min。上述刺激每天1种，每种刺激各3次，随机安排，使动物不能预知次日的刺激。14血清皮质酮测定于末次刺激后次日，断头取血，4放置3h后，4离心15min（4000g），分离血清，-40保存备测。检测

14、方法按试剂盒说明书操作。15蔗糖水摄取率测定根据6的方法操作。在正式实验前，先对大鼠进行蔗糖水摄取训练，即先用10g/L蔗糖水和饮用水同时喂养48h，然后断水24h，于次日清晨89时再次同时给予大鼠自由饮用10g/L蔗糖水和饮用水共1h，分别记录摄取量，根据下列公式计算蔗糖水摄取率（p摄取），并在实验的第7、14、21天各重复测量1次。p摄取=V蔗糖水（V蔗糖水+V饮用水）×100%16强迫游泳中静止时间测定根据文献7的方法进行。于末次应激24h后，先进行适应性强迫游泳15min，即将大鼠放入内径20cm、高60cm的圆形透明玻璃缸中，缸中加温度（25±1）的温水，深约25

15、cm，使大鼠在水中不能以后爪支撑身体、前爪攀附于缸壁，取出后用毛巾擦干放回笼中。每缸水仅使用1只大鼠。24h后再同样将大鼠放入水中，累计记录5min内大鼠在水中停止挣扎、呈漂浮状态的时间。每只大鼠仅进行1次实验，由两人同时观察记录，取平均值作为各大鼠强迫游泳静止时间的数据。17统计学方法采用SPSS130统计软件包进行随机区组设计的方差分析，组间两两比较的SNKq检验。2结果21各组大鼠体质量及血清皮质酮的变化表1结果显示，各组大鼠体质量均有增加，但增加量差异无显著性意义（P005）。模型组大鼠血清皮质酮含量显著升高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P001)。四逆散组大鼠血清皮质酮含量显著

16、低于模型组（P005），与正常对照组比较差异无显著性意义（P005）。归脾汤组、温胆汤组与模型组比较差异均无显著性意义（P005）。表1各组大鼠体质量增加量及血清皮质酮的变化比较（略）1         22各组大鼠蔗糖水摄取率变化表2结果显示，模型组大鼠蔗糖水摄取率显著降低，与正常对照组比较差异有显著性意义（P005）；四逆散组摄取率升高，与模型组比较差异有显著性意义 (P005)；归脾汤组、温胆汤组摄取率与模型组比较差异均无显著性意义（P005）。表2各组大鼠蔗糖水摄取率与强迫游泳中静止时间比较（略）23各组大

17、鼠强迫游泳中静止时间的变化表2结果显示，模型组大鼠强迫游泳中静止时间延长,与正常对照组比较差异有显著性意义（P001）；四逆散组大鼠静止时间减少，与模型组比较差异有显著性意义(P001)，与正常对照组比较差异无显著性意义（P005）；归脾汤组、温胆汤组静止时间与模型组比较差异无显著性意义（P005）。3讨论情志异常是肝郁证的主要病因,中医七情学说与应激理论类似,情志病因的实质是不良生活事件所形成的心理应激；同时中医认为情志与肝的关系最为密切,在对心理应激的调节过程中肝起着决定性的作用。临床上与慢性心理应激相关的病证如抑郁症,在诊断系统中的核心症状表现为兴趣或愉快的减少和抑郁情绪,辨证多属于中医

18、“郁证”范畴,疏肝理气解郁是最基本最重要的治则。前期研究建立了肝郁证动物模型的标准3，并使用多种不同应激条件随机组合起来的慢性应激程序，模拟临床上情志异常引发肝郁证的过程，并将10g/L蔗糖水摄取率与强迫游泳中静止时间两种行为学指标相结合，模拟人类肝郁证常见的抑郁、沉默寡言、默默不欲饮食以及喜叹息等症状所反映的兴趣缺乏和“无助感”的心理状态，结合逍遥散、四逆散和四君子汤的效应，建立并初步验证了慢性应激肝郁证大鼠模型2，4。本研究中的模型组大鼠10g/L蔗糖水摄取率减少、强迫游泳中静止时间增加，疏肝方剂四逆散可有效对抗的结果与前述的研究相同，证明这一模型具有良好的再现性。研究表明，慢性应激状态时

19、下丘脑垂体肾上腺轴(HPA)功能亢进，肾上腺皮质激素分泌增加是其主要表现之一8，常作为反映应激状态的重要指标之一，皮质酮则是大鼠肾上腺皮质激素的主要形式。在本研究中，模型组大鼠血清皮质酮浓度显著高于正常组，说明本研究的应激方案可明显升高HPA轴活性，有明确的应激效应，也与我们以往的研究结果相同2，4。同时，具有疏肝作用的四逆散可以显著抑制慢性应激引发的血清皮质酮浓度升高，而健脾养心方剂归脾汤和理气化痰方剂温胆汤则均无此效应，提示了慢性应激引起的血清皮质酮浓度升高与肝郁病机、疏肝治法之间的密切关系。临床上，对证候判断的正确与否，最终要通过方剂的疗效来验证，因此以方测证是验证动物模型中医证候性质的

20、重要方法之一。应用以方测证方法进行研究，必须设立其他方剂对照，并应选择功效相对明确、争议较少、认识相对一致的方剂进行干预实验，以增强测证的说服力9。前期研究4对比了经典的疏肝方剂四逆散、疏肝健脾方剂逍遥散和健脾方剂四君子汤对该模型行为学变化的效应，发现具有疏肝作用的四逆散和逍遥散均可明显改善慢性应激引起的大鼠血清皮质酮含量升高，并使10g/L蔗糖水摄取率和强迫游泳中静止时间恢复至正常水平，仅有健脾而无疏肝作用的四君子汤则无此效应，说明该模型属于肝郁证的可能性较大，而与脾虚证无关。本研究从临床应激相关疾病抑郁症较常使用的方剂中选择了归脾汤和温胆汤，与四逆散进行效应对比。结果显示，四逆散可明显改善

21、慢性应激引起的大鼠血清皮质酮含量升高、蔗糖水摄取率减少和强迫游泳中静止时间延长，而归脾汤和温胆汤均无此效应，基本上排除了该模型与心脾两虚或痰热证相关的可能性，从另一侧面支持该模型属于肝郁的推论。在本研究中，各组大鼠体质量增加量未见显著性差异，说明本研究中慢性应激刺激未能影响大鼠体质量，与我们以往的研究结果相同4。在一些中，慢性应激刺激对动物体质量影响的结果不一致10-11，提示体质量变化不能确定是由慢性应激引起。在肝郁证的多个诊断标准中，也没有体质量减少，提示体质量变化对于本模型意义不大。【文献】  1任路,李浩.关于肝郁证动物模型研究现状及存在问题的思考J.中医药学报，2006，34（4）:44.2金光亮,南睿,郭霞珍.慢性应激肝郁证大鼠模型的建立J.北京中医药大学学报，2003，26（2）:18.3金光亮,王胜兰.关于建立肝郁证动物模型的思考J.山东中医药大学学报,2004，28（6）:408.4于琦，金光亮.四逆散、逍遥散与四君子汤对慢性应激肝郁模型大鼠行为学影响的研究J.天津中医药,2007,6:509.5段富津.方剂学M.上海：上海技术出版社,1995：58，126，265.6Stathis Bekris，Katerina Antoniou，Spyros Daskas，et al.Behavioural