唑来膦酸联合甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞生长及化疗敏感性研究

1、唑来膦酸联合甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞生长及化疗敏感性研究         10-05-04 16:00:00     编辑：studa20             作者：龚海洋，蔡郑东，郑龙坡，李国东，华莹奇【摘要】  目的 本试验主要观察第3代二膦酸盐类药物唑来膦酸（zoledronic acid，ZOL）在体外对人骨肉瘤细胞株MG63生长的影响，进

2、一步研究唑来膦酸与甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）合用对MG63细胞的生长抑制是否具有协同作用。方法 采用MTT法分别检测不同剂量的唑来膦酸、甲氨蝶呤对人骨肉瘤细胞株MG63生长作用，检测唑来膦酸联合甲氨蝶呤对人骨肉瘤细胞株MG63的增殖抑制。结果唑来膦酸对MG63细胞的抑制效应与药物剂量及作用时间均成正比。单药唑来膦酸组剂量为1、10 mol/L时，MG63细胞凋亡率分别为9.91%、48.95%，单用甲氨蝶呤（1、10、100 mgL）时细胞凋亡率为37.68%、45.93%、52.418%，当唑来膦酸(10 mol/L)联合甲氨蝶呤（1、10、100 mgL）时MG63细胞的

3、凋亡率分别为51.96%、66.77%、69.23%，联合用药组与单药组相比差异有显著性(P<0.01)。唑来膦酸作用MG63细胞72 h的IC50值为9.39 mol/L。结论唑来膦酸对人骨肉瘤细胞株MG63有生长抑制作用，呈时间、剂量依赖性效应，唑来膦酸与甲氨蝶呤有协同作用。 【关键词】  骨肉瘤； MG63细胞系； 唑来膦酸； 甲氨蝶呤； 协同作用    Abstract: ObjectiveTo explore the possible interest of therapeutic approaches including nitroge

4、n-containing biphosphonate zoledronic acid using osteosarcoma cell lines MG63，and to investigate whether there is a synergism between zoledronic acid and methotrexate. MethodZoledronic acid alone or combined with methotrexate was used to treat human ostoesarcoma cells line MG63.The cell growth inhib

5、ition was assessed by MTT.ResultThere was a dose-dependent and time-dependent (1-100molL) inhibition of cell proliferation by zoledronic acid.IC50 value of zoledronic acid for therapy of MG63 after 72h was 9.39 mol/L.The cell growth inhibition rates of MG63 at 72 h was 48.95% in zoledronic acid (10

6、mol/L) group，and 37.68%,45.93% and 52.42% in methotrexate groups MTX（1,10 and 100 mgL）.When combined treatment of zoledronic acid (10mol/L) and methotrexate（1,10 and 100 mgL）was used，the cell growth inhibition rates were 51.96%,66.77% and 69.23%,respectively. The combination of zoledronic acid and m

7、ethotrexate demonstrated a synergistic effect. The differences were significant(P<0.01).ConclusionZoledronic acid has an explicit effect of inhibiting proliferation of MG-63 cells in a time-and dose-dependent manner.Its IC50 value is 9.39 mol/L. Zoledronic acid could induce apoptosis and has a sy

8、nergistic interaction with methotrexate.    Key  words：ostoeosarcoma；  MG63；  zoledronic acid；  methotrexate；  synergistic effect    骨肉瘤是一种好发于青少年的恶性肿瘤，有效化疗应用以前，即使采取较为彻底的截肢术，其治愈率也从未超过20%。自从70年代实施化疗以及新辅助化疗的应用以来，骨肉瘤的预后有了显著的改善，5年生存率也相应提高到50%80%。然而，骨

9、肉瘤的治疗远未达到完善的程度。目前在化疗方面仍存在的争议问题是：最理想的药物组合、给药时机、给药顺序和途径以及治疗的时间。    二膦酸盐是近年来研发的抗代谢性骨病的一类新药，主要用于治疗骨质疏松症、恶性肿瘤引起的高钙血症、骨痛症等。除具有强大的抑制骨吸收功能外，二膦酸盐的抗肿瘤作用也受到越来越多的重视。最近的研究表明：二膦酸盐对于骨肉瘤细胞有抗肿瘤作用。为探索骨肉瘤化疗的新方法，本试验观察了唑来膦酸(ZOL)对骨肉瘤MG63细胞系生长的影响，并联合骨肉瘤经典化疗药物甲氨蝶呤（MTX），观察唑来膦酸与甲氨蝶呤的协同作用。    1&#

10、160; 材料和方法    1.1  材料    人骨肉瘤细胞株MG63购自中国科学院。试剂：唑来膦酸、甲氨蝶呤为购自济南日月化工有限公司的高纯度原料药；DMEM、胎牛血清购自美国Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司；ELX800酶标仪(BIO-Tekinstruments，美国)。    1.2  方法    1 mol/L的唑来膦酸母液滤过0.22 m的过滤器，用DMEM培养基将唑来膦酸滤过液稀释成1 molL、5 molL、

11、10 molL、20 molL、50 molL、100 molL。1 g/L的甲氨蝶呤母液滤过0.22 m的过滤器，用DMEM培养基将滤过液稀释成1 mgL、5 mgL、10 mgL、20 mgL、50 mgL、100 mgL。    MG63细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置5%CO2、饱和湿度37培养箱中培养。细胞贴壁生长，0.125%的胰蛋白酶消化传代，13 d换液1次。    取对数生长期的MG63细胞按1×104孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 l，24 h后换液。设空白对照组(不接种细胞，只加

12、培养液)、对照组(接种细胞，不加化疗药物)及实验组(唑来膦酸、甲氨蝶呤单药组及联合用药组加不同浓度的干预药物)，每组设3个复孔。分别继续培养48 h、72 h、96 h后加入MTT试剂(5 g/L)20 l，空白对照组加入20 lPBS，继续培养4 h后吸出上清，每孔加DMSO 150 l，置水平摇床上摇10 min后，在酶联免疫测定仪上选择波长540 nm，空白对照孔调零，测定各孔吸光度A。计算细胞生长的抑制率。抑制率=(1-实验组A平均值对照组A平均值)×100%。根据直线回归法计算唑来膦酸作用于MG63细胞的IC50值。    2  结果    2.1  唑来膦酸对人骨肉瘤MG63细胞系生长的抑制作用    正常人骨肉瘤MG63细胞系呈梭形或类圆形，贴壁生长。生长力旺盛。唑来膦酸(1、10 molL)处理72 h的MG63细胞梭形不明显，有些细胞变得细长，有些细胞变得圆钝；唑来膦酸20 mol/L处理的MG63细胞梭形消失。细胞核变小变形，胞浆明显变少；唑来膦酸10