单核细胞中性粒细胞分离方法及注意事项

1、单核细胞分离方法将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的Ficoll Hypaque分离液表面，以450 g离心25min收集单个核细胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮细胞，置于6x 6 cm 玻璃培养皿中，在5 CO2 、37 下孵育2 h，收集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培养液悬浮单核细胞，Wright染色计数单核细胞>95，调整细胞密度为4×10ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，在5 CO2，37 下培养24 h，离心收集上清液，冻存于一70 冰箱中备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。细胞分离中需要注意的几个

2、问题1.如果您要做细胞培养，记住实验中所用的试剂（分离液，洗涤液等）、器械等都要是无菌消毒的，并注意实验中的无菌操作。2. 离心转速单位及时间：目前国外的文献报道基本上用g为单位，注意g和转速（rpm）的换算。3.离心温度：有的要求室温，有的要求4摄氏度。实验的操作要求尽可能熟练，连贯。4.在用Ficoll分离单个核细胞（PBMC）时，通常含有少量的红细胞，对于一般的实验影响不大，如果实验要求较高，可采取裂解液（有的需要无菌），并注意裂解时间控制，以免影响单个核细胞的活性。5. 在用Percoll配不连续梯度时（一般用高渗NaCl），注意各成份体积的准确性，否则密度与预期的不一样，影响分离效果

3、。6.用全血离心效果比全血稀释后再离心效果差，稀释一般等体积稀释一倍。7.分离液与样本的体积比：一般应小于1：2（即一般为1体积分离液，2体积样本，不宜超过2体积，小于2体积均可）8.洗涤液的成分：不同文献报道不一，有的使用PBS，有的为Hanks，KRP等，可自己选定。主要是离子浓度及成份的不同，有的含有 Mg2+,Ca2+。9. 细胞活性：0.2%台盼蓝染色35分钟，镜下观察计数死亡细胞（蓝染）。中性粒细胞分离的方法1、标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-p

4、oor Plasma, PPP）。3）余下的沉降全血加入5ml6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。5）沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。6）悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155MNH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最

5、终用HBSA（含钙）重悬。8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。2、不连续的密度梯度血浆Percoll离心法 1）先制备Percoll储存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的体积比为9：1。3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma, PPP）。4）余下的沉降全血加入5ml6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。5）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。6）沉淀的细胞用23mlPPP重悬7）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、23ml细胞悬液，275gX10min.8）单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间，中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间。血小板可通过 25%Percoll离心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离