发作性睡病与HLA

1、    发作性睡病与HLA-DQB1*0602基因的相关性研究            作者：时间：2007-11-23 10:15:00                          &

2、#160;  作者;蒋天舒，周晔，陈 燕，陈 波，谷明莉，邓安梅，仲人前摘要  目的  探讨发作性睡病与HLA-DQB1基因的相关性。方法  对30例发作性睡病患者的临床资料进行分析。用序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）分型技术测定HLA-DQB1等位基因''并与44例健康人检测的数据进行比较。 结果  发作性睡病患者组DQB1*0602基因频率为40%，与正常对照组9.09%相比较明显增高；未检出DQB1*0401-0402基因，与正常对照组9.09%相比较，经统计学分析，差异有显著性（P<0.05

3、）。结论  HLA-DQB1*0602基因为中国发作性睡病人群的易感基因；HLA-DQB1*0401-0402基因为中国发作性睡病人群的保护基因。        关键词  发作性睡病;HLA基因;易感性        Study on the association between HLA-DQB1*0602 genes and narcolepsy        JIANG Tian-shu &

4、#39;'ZHOU Ye'' CHEN Yan''et al. Labortary Diagnostics'' Changzheng Hospital''Second Military Medical University''and Clinical Immunology Center of PLA'' Shanghai 200003'' China        Abstract  Objective&#

5、160; To investigate the association between HLA-DQB1 genes and narcolepsy. Methods  HLA typing were performed in 30 patients with narcolepsy by HLA-DQB1 resolution PCR-SSP（sequence specific primers）''then the frequencies of alleles were analyzed compared with normal controls.Result

6、s  The frequencies of DQB1*0602 in narcolepsy were significantly higher than normal controls（40% versus 9.09%）''while the frequency of DQB1*0401-0402 was markedly lower（0 versus 13.64%）. Conclusion  HLA-DQB1*0602 were susceptible alles for narcolepsy while  HLA-DQB1*0401-

7、0402 may be protective.        Key words  narcolepsy;HLA genes;susceptible        发作性睡病（narcolepsy）是一种常见于青春期前起病，并持续终生的慢性神经系统疾病。临床以不可抗拒的白天睡眠过多为特征''尚可合并猝倒、入睡幻觉和睡眠瘫痪1。近年来国外已有关于发作性睡病与HLA抗原基因相关性的研究报道2''3。本病对患者身心健康及生活质量有很大影响。

8、本病病因不明，其发生可能是环境因素与遗传因素相互作用的结果4。我们用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法对HLA-DQB1等位基因进行检测，对它们在特异性发作性睡病及正常人的分布进行比较，以了解它们与特异性发作性睡病遗传易感性的关系。        1  材料与方法        1.1  研究对象  特异性发作性睡病组：中国汉族患者30例，其中男24例，女6例；年龄940岁，平均18岁。全部患者经详细询问及查体，脑电图、头颅CT和

9、（或）MRI检查无异常所见，确诊为发作性睡病。对照组：为与患者同地区的、与患者无血缘关系的、无特异性发作性睡病发病史的健康人群，共44例。        1.2  实验材料         主要试剂  Taq DNA聚合酶（Promega公司）、Qiagmp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN公司）、HLA-DQB1基因分型试剂盒（ONE-LAMBDA公司）。       

10、;  主要仪器  PCR自动扩增仪（GeneAmp 9600''PE''USA）、微量凝胶电泳系统（Abgeme，英国）、紫外分光分析系统（MultiImageTM''Aipha Innotech Corporation）。        1.3  诊断标准  参照睡眠障碍国际分类（ICSD）5，6''并结合发作性睡病的临床特征：（1）患者有白天过度嗜睡或突然肌无力主述。（2）每天有频繁小睡或突然进入睡眠状态。（3）情感诱发致突然双

11、侧肌张力消失（猝倒）。（4）多导睡眠图（polisomnography，PSG）记录：睡眠潜伏期<10 min；REM睡眠潜伏期<20 min；多次小睡时间MSLT中平均睡眠潜伏期<5 min；两次以上睡眠开始时REM发作。        1.4  实验方法        基因组DNA的制备  应用DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞中的DNA。取2 l的DNA样品，用紫外分光光度法检测样品的A值及纯度，最后DNA调准为100 g/ml。&#

12、160;      实验方法  应用PCR-SSP（polymerase chain reaction/sequence primers）方法检测HLA-DQB1位点的基因型。基因频率采用直接计算法。按Woolf公式计算相对风险度（RR）来评估该病与等位基因的关联强度。2检验对RR进行显著性检验。PC<0.05为差异有显著性。将含有DNA、Taq DNA聚合酶、PCR-Mix的混合液以每孔10 l的量加入HLA-DQB1基因分型板的32个含特异性引物的小孔；以每孔12 l的量加入HLA-DQB1基因分型板的32个含特异性引物的小孔。PCR

13、扩增条件为96 预变性130 s，63 退火和延伸60 s，1个循环；96 变性10 s，63 退火和延伸60 s，9个循环；96 变性10 s，59 退火50 s，72 延伸30 s，20个循环。        基因型的确定  以2%的琼脂糖凝胶电泳，90V稳压15 min。紫外灯下观察，根据PCR产物的有无及分子量大小对照HLA-DQB1基因分型格局表确定基因型别。        1.5  统计学方法  用直接计数法计算基因频率。两组间基因频

14、率的比较采用2检验。P值均用Bonferron法进行校正P值（Pc）''Pc<0.05有统计学意义。        2  结果        发作性睡病患者组和正常对照组HLA-DQB1基因频率的分布：发作性睡病组DQB1*0602基因频率（40%）较正常对照组（9.09%）增高（2=20.11，P<0.05 ）；在发作性睡病组中未检出DQB1*0401-0402''基因频率较正常对照组（13.64）明显降低，经

15、统计学分析差异有显著性（2=7.168''P<0.05）。见表2。 表2  HLA-DQB1基因在发作性睡病与正常对照组中的分布     3  讨论        HLA类分子在自身反应性T细胞的成熟中以及T细胞活化和免疫识别中起重要作用。HLA具有高度多态性，不同的HLA分子因结构上的差别，特别是抗原结合部位上某些氨基酸残基的不同，在一定程度上决定了HLA分子对自身抗原的亲和力，从而直接影响它们递呈抗原肽并激活特异性T细胞的能力。HLA类抗原分子多态性

16、的氨基酸序列主要存在于分子外侧功能区的3个超变区中，这种多态性决定了不同HLA类分子与抗原结合部位即裂隙的细微差别，并且影响与抗原肽的结合。在HLA分子、抗原肽及T细胞受体三分子复合物的相互作用中''因为某些原因机体不能区分自我和非我''导致自身免疫反应的发生。据此推测，可能是这一类将自身抗原递呈给抗原特异性T细胞的特殊HLA分子携带着发作性睡病的遗传易感性，且可影响病情进展。        本研究采用PCR-SSP方法对HLA-DQB1等位基因进行了检测，结果发现HLA-DQB1*0602在发作性睡病

17、及正常对照组中的基因频率分别为40%和9.09%，经统计学分析，差异有显著性 （2=7.168''P<0.05）。此结果进一步证实了HLA-DQB1*0602为发作性睡病的易感基因，与国外相关报道一致710。在发作性睡病组中未检出HLA-DQB1*0401-0402''而该基因在正常对照组中的频率为13.64%，经统计学分析差异有显著性。这说明HLA-DQB1*0401-0402可能为该病的保护基因。不同的HLA类基因产物参与递呈不同的抗原肽，并诱发出特异性和强度不同的免疫应答。HLA-DQB1*0602可能在免疫应答过程中起重要的调控作用，使T细胞激活，

18、导致免疫反应增强，参与发作性睡病病变的形成。HLA-DQB1*0401-0402在免疫反应的调控过程中可能起到负反馈作用，导致具有不同HLA类抗原等位基因的免疫应答能力和对发作性睡病易感性的差异。        HLA-DQB1*0401-0402可能为该病的保护基因，这在过去的研究中从未提及，也许是我们HLA-DQB1高分辨的分型，使分型更为细致所发现，也可能因为过去研究例数较少所致。在中国人群中，发作性睡病患病率只有0.04%左右11，12。本研究亦显示，中国发作性睡病患者与DQB1*0602存在一定的相关性，但要对发作性睡病患者

19、做进一步的诊断、治疗，尚需更深层次的探索。参考文献    1  Kotagal S''Hartse K    M'' Walsh JK. Characteristics of narcolepsy in preteenaged children. Pediatrics''1990''85:205-209.        2  Kawashima M'' Tamiya

20、G'' Oka A''et al. Genomewide association analysis of human narcolepsy and a new resistance gene.Am J Hum Genet''2006''79（2）:252-263.         3  Tanaka S'' Honda Y'' Inoue Y'' et al. Detection of autoantibodies

21、 against hypocretin'' hcrtrl'' and hcrtrl in narcolepsy: anti-Hcrt system antibody in narcolepsy.Sleep，2006，29（5）:633-638.         4  左启华.小儿神经系统疾病，第2版.北京:人民卫生出版社''2002，959-964.        5  American Sleep diso

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