利用废菌渣生产单细胞蛋白饲料研究

1、 单细胞蛋白营养物质丰富,菌体中蛋白质含量高达40%80%,其中氨基酸组分齐全,赖氨酸等必需氨基酸含量较高,同时富含维生素等(徐抗震等,2003。废菌渣是微生物发酵后的基质废料,菌渣中含有比较丰富的营养成分,粗蛋白质含量为8%,粗脂肪0.8%,粗纤维17%,同时含有丰富的钙、锌、铜、磷、铁、镁等元素,如果直接用作饲料,由于其蛋白质含量低,生物学利用率较差(李志香和王一鸣,2007;吴琼等,2003;汪水平和王文娟,2003。本研究通过直接利用废菌渣或以废菌渣为主料,再添加一些辅料和一些氮素养料,采用混合菌协同固态发酵技术,把废菌渣变成单细胞蛋白饲料。1材料与方法1.1材料豆芽汁蔗糖培养基:黄豆

2、芽100g,蔗糖50 g,琼脂20g,水1000mL,pH自然,在121下,灭菌20min。液体种子培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,水1000mL,pH自然,在121下灭菌20min。黄豆芽100g,蔗糖50g,水1000mL,pH自然,在121下灭菌20min。基础发酵培养基:废菌渣90%,麸皮10%;尿素2%;KH2PO42%,MgSO4·7H2O1%;料水比12.53.0;pH自然,121灭菌20min。固体发酵培养基:(1不同碳源固体发酵培养利用废菌渣生产单细胞蛋白饲料研究安徽科技学院生命科学学院吴萍李正鹏饶圣宏黄结贵摘要本文以废菌渣为主要原料,利用酿酒酵母(Saccha

3、romyces cerevisiae和黑曲霉(Aspergillus niger两菌株进行混合固态发酵生产单细胞蛋白饲料。通过单因素试验和正交试验确定最佳培养条件,结果表明,各因素对粗蛋白质含量的影响为废菌渣与麸皮的比例>培养时间>氮源>水料比;混菌固态发酵的最佳培养条件为废菌渣80%麸皮20%,硝酸铵2%,尿素1%,KH2PO42%,MgSO4·7H2O1%,水料比为2.51,pH为4,接种量为20%,培养时间为120h时,此时粗蛋白质含量最高,由发酵前的9.61%提高到23.28%。关键词废菌渣;酿酒酵母;黑曲霉;单细胞蛋白;正交试验中图分类号S816.35文献

4、标识码A文章编号1004-3314(200822-0038-04 AbstractIn this study,single cell protein feed was produced through the mixed solid-state fermentation of two strains,Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger,using the fungi residues as mainly raw material.The optimum cul-ture conditions were determined by the

5、 methods of single factor and orthogonal test.The results showed that the influences of all the factors on the crude protein content was the ratio of fungi residues to bran>culture time>nitrogen source> water-materials ratio;the best culture conditions of mixed solid-state fermentation were

6、 fungi residues80%,bran20%, NH4NO22%,urea1%,KH2PO42%,MgSO4·7H2O1%,the water-materials ratio2.51,pH4,vaccination20%,the culti-vated time120h.The crude protein content increased from9.61%to23.28%and reached its highest.Key wordsfungi residues;Saccharomyces cerevisiae;Aspergillus niger;single cell

7、 protein;orthogonal experiment注:1.废菌渣;2.废菌渣麸皮;3.废菌渣玉米粉。图1不同碳源对粗蛋白质含量的影响基:将废菌渣100%,废菌渣90%玉米芯10%分别代替基础发酵培养基中的碳源,其他成分不变。(2不同氮源固体发酵培养基:将硝酸铵2%,硫酸铵2%,硝酸铵1%+尿素1%,硫酸铵1%+尿素1%分别代替基础发酵培养基中的氮源,其他成分不变。子有限公司,101-3-BS 电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂,TH2-82气浴恒温振荡培养箱(上海跃进医疗器械厂,LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂,JA2003N 电子天平(上海精密科学仪器有

8、限公司,pHS-3C 精密pH 计(上海精密科学仪器有限公司,SW-主要试剂NaOH (AR 合肥工业大学化学试剂厂,硼酸(AR 国药集团化学试剂有限公司,浓硫酸(AR 蚌埠市皖达试剂厂,盐酸(AR 中国蚌埠化学试剂厂,蔗糖(AR 国药集团化学试剂有限公司。1.2方法1.2.1斜面培养在无菌条件下,将酵母菌和黑曲霉菌种接种至新制的豆芽汁蔗糖斜面培养基和PDA 斜面培养基上,30恒温培养72h 。无菌水将活化的斜面菌种分别洗下并接种到盛有80mL 液体种子培养基的250mL 三角烧瓶中于30,160r/min 振荡培养72h 。灭菌的固体发酵培养基(10g/250mL 三角烧瓶中,置于30恒温箱

9、中培养72h 。待培养结束后,将培养物置于80烘箱中风干,测粗蛋白质含量。法。将发酵好的培养基烘干至恒重,准确称量0.2g 样品放入干燥的消化管中,再加入0.4g 的混合催化剂(K 2SO 4CuSO 4=31后,并加20mL 的浓硫酸,然后进行消化,直至消化液呈透明淡绿色为止,消化完毕后,静置,待消化管中液体冷却后,缓慢沿试管壁加蒸馏水20mL ,然后进行蒸馏,在250mL 三角烧瓶中加入2%H 3BO 350mL 和23滴指示剂(0.1%甲烯蓝0.1%甲基红=14,将该瓶套在接收管上,直至接收瓶液面高于150mL 时,取下接收瓶,用0.05mol/L HCl 滴定接收瓶内的溶液,滴定溶液由

10、绿色变成淡紫色时为止,记下消耗HCl 的毫升数,计算粗蛋白质含量。粗蛋白质含量(%=(V -V 0N ×0.014×A ×100/W ;式中V 为消耗HCl 的毫升数,mL ;V 0为空白试验时消耗HCl 的毫升数,mL ;N 为HCl 的当量浓度,mol/L ;0.014为1mL HCl 的克当量数;A 为固定系数(6.25;W 为试样重量,g 。2结果与分析2.1不同碳源对粗蛋白质含量的影响以基础发酵培养基为基础,改变培养基中的碳源,其他条件不变,分析不同碳源对粗蛋白质含量的影响,结果见图1。由图1可知,当废菌渣与麸皮以90%与10%的比例混合时产粗蛋白质含量

11、最高,而用废菌渣或废菌渣与玉米粉作为碳源产粗蛋白质含量次之。这可能是因为麸皮中,含有混菌发酵所需多糖、蛋白质、维生素和矿物质成分,对混菌生长有促进作用。但在废菌渣加入玉米粉,粗蛋白质含量增加不明显,可能是玉米粉颗粒比较细,造成培养基黏性增大,不利于透气。基础培养基为基础,改变培养基中的氮源,其他成分不变,分析对粗蛋白质含量的影响,结果见图2。氮源的作用是合成细胞物质如蛋白质、氨基酸、核酸等主要成分,从生长角度看,微生物生长需要充足的氮源。而废菌渣中营养成分相对比较贫乏,尤其氮源含量比较少,所以,以废菌渣为主123不同碳源粗蛋白质含量/%图5不同pH 值对粗蛋白质含量的影响注:1尿素;2硫酸铵;

12、3硝酸铵;4硫酸铵+尿素;5硝酸铵+尿素。图2不同氮源对粗蛋白质含量的影响要发酵原料的培养基,须添加必要的氮源;另一方面加入无机氮源并通过微生物代谢使其转化为蛋白质,能够使获得的蛋白质绝对数量增加,直接有效地提高废菌渣中的粗蛋白质含量。由图2可见,培养基中的氮源种类,对发酵产物中粗蛋白质的含量具有一定的影响,其中以硝酸铵+尿素影响效果最好,尿素次之。酵基础培养基为基础,改变培养基的水料比,其他成分不变,分析其对粗蛋白质含量的影响,结果见图3。菌体生长需要适宜的水分,固态发酵物料中的含水量是影响蛋白质产量的重要因素,含水量过高会导致培养基黏结成块,多孔性降低;含水量过低会使培养基膨胀程度降低,影

13、响物料利用和菌体生长。从图3可见,含水量与料水比为2.81时,粗蛋白质含量最高。以基础发酵培养基为基础,采用不同的接种量进行接种,其他条件不变,分析其对粗蛋白质含量的影响,结果见图4。由图4可知,粗蛋白质的含量随接种量的增加而增加,当接种量达到20%以后粗蛋白质含量不再增加,趋于平缓。原因可能是接种量大小可影响微生物生长滞留期的长短,一般接种量越大滞留期越短。相同发酵时间内滞留期越短,微生物达到对数生长期时间越短,进而可以获得更高的微生物细胞,即菌体蛋白。接种量达到一定量后继续增加接种量,达到滞留期的时间基本不变,接种量增大对微生物菌体获得量没有影响,进而对发酵产物中粗蛋白质的含量没有影响,因

14、此选择接种量为20%最佳。不同pH 值对粗蛋白质含量的影响以发酵基础培养基为基础,改变培养基的pH ,其他成分不变,分析其对粗蛋白质含量的影响,结果见图5。发酵培养基中初始pH 值对微生物的生命活动的影响很大,主要的作用是引起微生物细胞膜电位的变化,从而影响微生物对营养物质的吸收,因此,培养基中的pH 值过高或过低时都不利于细胞的生长,甚至会引起细胞的死亡。由图5可见,培养基中不同pH 对发酵产物中粗蛋白质的含量具有一定的影响,随着pH 升高,发酵产物中粗蛋白质含量逐渐降低,当pH 值为4时对菌种的生长有利,粗蛋白质含量较多。发酵基础培养基为基础,改变培养时间,其他成分不变,分析其对产粗蛋白质

15、含量的影响,结果见图6。由图6可知,发酵时间对发酵产物中粗蛋白图3不同水料比对粗蛋白质含量的影响图4不同接种量对粗蛋白质含量的影响19.0023不同氮源粗蛋白质含量/%19.504519.002.51不同水料比粗蛋白质含量/%2.813.013.313.5119.005不同接种量/%粗蛋白质含量/%1015202518.5018.0017.5017.0016.504不同的pH 值粗蛋白质含量/%56784872培养时间/h粗蛋白质含量/%120序号A B C D 粗蛋白质含量/%1.951.230.471.27图6不同培养时间对粗蛋白质含量的影响表1正交试验因素水平表2正交试验结果因素A (废

16、菌渣麸皮/%B (硝酸铵尿素/%C (水料比D (培养时间/h1100010 2.51722901011 2.819638020213.01120表3正交验证试验表培养基组合废菌渣麸皮/%硝酸铵尿素/%水料比培养时间/h 粗蛋白质含量/%A 3B 2C 1D 3(表观802011 2.5112022.18A 3B 3C 1D 3(最优8020212.5112023.28质的含量影响较大,培养96h 时获得的发酵产物的粗蛋白含量最高。发酵时间再延长,发酵产物中蛋白质含量反而降低,分析其原因是由于培养时间过长导致菌体死亡进而自溶所致。2.2固态发酵条件的正交优化在单因素试验的基础上,采用L 9(3

17、4正交试验法对碳源及组分配比、水料比、培养时间、硝酸铵尿素添加量这4个影响因素进行优化。正交试验因素水平见表1。结果见表2。经极差分析可见,各因素对产物粗蛋白质含量的影响次序为A >D >B >C ;其中废菌渣麸皮的比例是主要影响因素。最佳组合为A 3B 3C 1D 3,但该组合不在9次试验内,而表观最佳组合是A 3B 2C 1D 3,为验证正交试验结果,按正交最佳组合和表观最佳组合的配方进行验证试验,结果见表3。从表3可见,按最佳组合进行发酵所产生的粗蛋白质含量最高。因而综合单因素试验和正交试验结果可见,最佳发酵条件是:废菌渣麸皮为8020,硝酸铵尿素为21,水料比为2.5

18、1,培养时间为120h ,发酵物中的粗蛋白质含量最高,达23.28%。3讨论废菌渣中含有较多的营养物质,但直接作为饲料,其蛋白质含量低,如果直接丢弃会污染环境,采用混菌发酵技术可提升废菌渣的利用价值。用于生产单细胞蛋白饲料的微生物种类较多,如木霉、黑曲霉、根霉等霉菌和产阮假丝酵母、白地霉、啤酒酵母等酵母菌。本试验采用了黑曲霉和啤酒酵母两菌株进行了混菌发酵试验,从发酵结果显示,发酵产物中的蛋白质含量由发酵前的9.61%提高到23.28%。4结论4.1废菌渣经不同因素处理后,粗蛋白质含量有明显升高,经正交优化后,粗蛋白质含量由最初的9.61%提高到23.28%。4.2经极差分析,得出各因素对产粗蛋白质含量的影响是废菌渣与麸皮的比例>培养时间>硝酸铵尿素>水料比。4.3根据本次试验的研究结果,综合考虑各方面因素,确定产粗蛋白质的最佳固态发酵条件为:废菌渣80%、麸皮20%,硝酸铵2%,尿素1%,KH 2PO 42%,MgSO 4·7H 2O 1%,水料比为2.51