内皮素在NG-硝基-L-精氨酸甲酯引起的高血压的作用

1、    内皮素在NG-硝基-L-精氨酸甲酯引起的高血压的作用        摘要目的和方法：在口服NG-硝基L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine-methlester,L-NAME)造成的大鼠高血压模型上，观察血浆内皮素(endothelin,ET)和亚硝酸盐(NO2)含量，血管内皮素水平和NO合酶(NO synthase,NOS)活性和ET受体的变化，以及应用ET受体阻断剂JKC-301对高血压的影响。结果：L-NAME引起动物血压升高，心肌肥大，血浆NO

2、生成减少，血管NOS活性降低(P0.01)，血浆和血管ET含量分别增加86%和79%(P0.01)，血管ET受体最大结合(Bmax比对照组增加113%(P0.01)。使用JKC-301治疗，显著减轻动物的高血压和心肌肥大程度，增加血浆NO2含量和血管NOS活性。结论：ET参与了抑制内皮舒张因子NO所致高血压的发病过程。主题词高血压；一氧化氮；内皮素 Role of endothelin in NG-nitric-L-arginine metylester-induced hypertension in ratsLI Xia,WANG Xiao-Hong,LI Liang,PANG Yong-Z

3、heng,SU Jing-Yi,TANG Chao-Shu,LIU Nai-KuiInstitute of Cardiovascular Basic Research,Beijing Medical University,Beijing (100083)Abstract AIM and METHODS:On the model of rat hypertension induced by NG-nitric-L-arginine-metylester(L-NAME),contents of plasma endothelin(ET) and NO?2,changes of aortic ET,

4、NO synthase (NOS)activity and ET receptor binding,and therapeutic effects of ET receptor blocker-JKC-301 were observed. RESULTS：L-NAME resulted in severe hypertension and myocardial hypertrophy and reduced the plasma NO?2 content and aortic NOS activity(P0.01).The ET contents in plasma and aortic ti

5、ssue enhanced 86% and 79%,respectively(P0.01), and the Bmax of ET receptor binding increased 113%(P0.01).After treatment with JKC-301,hypertension and myocardial hypertrophy were obviously decreased,plasma NO?2 and aortic NOS activity were markedly increased.CONCLUSION：ET mediates the pathogenesis o

6、f hypertension induced by inhibiting endothelial derived relaxing factor (EDRF)/NO.MeSHHypertension;Nitric oxide;Endothelin.血管内皮功能紊乱在高血压发病中具有重要作用。血管内皮产生的收缩因子(以内皮素endothelin，ET为代表)增加和或舒张因子(以内皮舒张因子EDRFNO为代表)的不足，都可以引起高血压的发生发展1。但高血压发病过程中ET与NO间的相互作用关系，尚未完全阐明。本工作在长期使用NO合酶(NO synthase,NOS)抑制剂NG-nitro-L-arg

7、inine-methlester(L-NAME)复制的大鼠高血压模型上，观察血浆和血管ET含量和血管受体的变化，以及应用ET受体阻断剂JKC-301对高血压的影响，以探讨ET在EDRFNO缺乏诱导的高血压发病中的意义。材料和方法(一)动物模型及分组：实验选用180200 g雄性Wistar大鼠，随机分为3组，每组10只。(1)L-NAME高血压组：参照Sigmon等方法2复制模型，将L-NAME溶于水中(75 g100 L)喂饲3周。(2)L-NAME+JKC301组：饮用L-NAME液同第1组，1周后加用JKC301，尾静脉注射1.34 mgkg，每日1次，连续2周。(3)对照组：常规喂饲，

8、不作特殊处理。(二)标品采集：1周时清醒动物尾动脉测压，3周时(停药后24 h)20%乌拉坦(5 mgkg ip)麻醉，肝素抗凝，颈动脉插管，稳定30 min后生理多导仪(日本光电，AP-611G)记录平均动脉压MABP，然后放血处死动物。收集并分离血浆，称取心脏及左心室(包括室间隔)重量，计算心重体重(HWBW，mgg)、左心室重全心重(LWHW，mgmg)比值。摘取胸腹全长主动脉，各5只动物血管分别进行NOS活性等测定与ET受体结合实验。(三)血浆NO2水平测定：将血浆中硝酸盐(NO3)经镉柱还原为亚硝酸盐(NO2)，加入Griess液测定血浆NO2浓度3。(四)血管NOS活性测定：取约5

9、0 mg腹主动脉匀浆，制备酶提取液，按我室张新波等4报告的方法测定NOS活性，(即3H-L-Arg生成H-citraulline值)。考马斯亮兰法进行匀浆蛋白定量。(五)血浆及血管ET放免活性(ET-ir)测定：取血浆和约10 mg胸主动脉按放射免疫药盒说明书测定ET-ir。(预先经C18柱纯化处理)。(六)制备血管平滑肌细胞粗制膜，行ET受体结合实验5取动物全长胸主动脉，擦去血管内、外膜，参照Lopez等6的方法，血管组织先匀浆，10 000g,20 min离心后取上清再离心(48 000×g,30 min),然后取沉淀匀浆47 800 g 离心30 min再留沉淀混悬于含0.25

10、 mmol葡萄糖、25 mmol Tris、1mmolPMSF(pH7.5)的溶液中，制成血管平滑肌细胞粗制膜，-70保存。取细胞膜悬液，分别加入不同浓度的125I-ET1(5-800pmol/L),终容量0.25 mL，双平行管30孵育30 min,经0.45m微孔滤膜在Millipore 上抽滤，冷PBS液冲冼，非特异管为1mmol/L ET1,计数仪测放射活性。总结合减去非特异的ET1受体结合。Scatchard plot 分析计算最大结合(Bmax)与解离常数(Kd)。实验试剂：JKC-301、ET1(人)、125I-ET1由美国phoenix pharm 公司惠赠。L-NAME购自S

11、igma CO.3H-L-Arg为Dupont NEN产品，(229.4×1010Bqmmol)。各组实验数据均以±s表示，两组资料组间t检验，多组资料方差分析组间q检验作统计学处理。结果一、MABP及HWBW、LW/HW变化：口服L-NAME引起大鼠高血压和心肌肥大。与对照组比较，服用L-NAME1周及3周MABP分别增加26%和48%(P0.01)；3周后动物HW/BW、LW/HW比值分别增加29%和15%(P0.01)。LNAMEJKC301组动物在用JKC301治疗前(喂LNAME 1周)L-NAME高血压组相(近P0.05)。治疗结束时MABP、HWBW与LWHW

12、比值都明显降低(P2水平与血管NOS测定L-NAME高血压动物血浆NO2浓度较对照组低68%，血管NOS活性低70%，(P0.01)。JKC-301治疗动物血浆NO2比单纯L-NAME组口服增加1倍，(P0.01)，血管NOS活性亦显著增加(+110%，P0.01)见表2。表1平均动脉血压和心重量的比较Tab 1Comparison of mean arterial blood pressure and heart weight(±s,n=10)GroupMABP(mmHg)Heart Weight1week3weeksHW/BW(mg/g)LW/HW(mg/mg)Control98

13、±4104±43.17±0.140.71±0.05L-NANE124±8*154±6*4.12±0.27*0.82±0.07*L-NAME+126±7128±83.52±0.300.76±0.06JKC-301*P0.01，vs control group;P0.05，P0.01，vs L-NAME group 表2不同组血浆ET-1、NO2和动脉组织NOS、ET-1及ET1受体的比较Tab 2Comparison of plasma ET-1 and NO2，aortic

14、NOS and ET-1 and of ET-1 binding in different group(±s,n=5)GroupPlasmaAortaET1 bindingNO2(mol/L)ETir(fmol/mL)NOS activity(pmol/ min1）ETir(fmol/g.ww)Bmax(fmol/)k（d）(pmol/L)Control5.21±0.413.24±0.2016.3±1.1104±84.6±0.3114±17L-NAME1.66±0.11*6.02±

15、0.54*4.9±0.5*186±10*9.8±0.4*126±15L-NAME3.25±0.2610.3±1.2+JKC-301*P0.01，vs control group；P0.01，vs L-NAME group 三、血浆ET1、血浆ET1及Bmax、KD变化：L-NAME高血压动物血浆和血管ET1含量比对照组增加85%、78%(P0.01)。高血压动物血管ET1受体Bmax比对照组增加1倍多，(P0.01)，而解离常数(kd)并无明显改变。结果见表2、1、2。Fig 1Saturation curve of specific

16、125I ET-1 binding1特异性ET1受体的饱和曲线Fig 2Scatchard plot analysis of ET-1 binding in control and L-NAME rats2对照组和L-NAME组大鼠ET-1受体的Scatchard作分析讨论高血压普遍并存内皮细胞损伤，内皮舒张功能减退，EDRF/NO生成减少，NOS活性及基因表达降低。补充NO前体L-Arg有改善高血压作用。Johnson等7认为L-Arg/NO途径障碍参与高血压发病，而长期应用NOS抑制剂(L-NAME、L-NNA)可复制出典型高血压模型2，ET是体内已知作用最强的缩血管物质和细胞丝裂素原，在

17、高血压发病中的作用受到高度瞩目8。Thompson等9曾报告ET参与了应用L-NAME引起的急性升压效应。体内NO与ET相互作用参与循环稳态的网络调节，ET可促进NO合成与释放，NO抑制ET的信号转导。本实验在慢性应用NOS抑制剂L-NAME诱导的高血压大鼠，MABP升高，心肌肥大，血浆ET-ir和血管ET-ir增高，血管ET受体增加，(P0.01)，表明NOS抑制剂不仅使ET合成与释放增加，而且引起ET受体上调。Banting等10发现在急性NOS抑制剂引起的高血压有ET受体活性的显著增加。JKC-301是ET受体阻断剂，结构为D-Asp-Pro-D-lle-Leu-D-Trp环五肽，使用J

18、KC-301可显著降低血压，抑制心肌肥大发生，JKC-301还可显著减轻高血压大鼠血浆NO2含量的减少及血管NOS活性的降低(P0.01)。总之，L-NAME引起的动物高血压，其ET合成，释放增加和血管ET受体上调，而ET受体阻断剂能抑制L-NAME引起的高血压，这些结果表明，ET参与和介导了NO缺乏引起的高血压发生。*山西职工医学院作者单位：北京医科大学心血管基础研究所(北京100083)参考文献1唐朝枢，田青，温进坤，等.内皮衍化舒张因子(EDRF/NO)与内皮衍化收缩因子(EDCF/ET)相互关系的研究.生理通讯，1994，增刊：28.2Sigmon DH,Beierwaltes W.N

19、itric oxide influence blood flow distribution in renovascular hypertension.J Hypertens,1994,24(Suppl 1):134.3张灵芝，谭敦勇，周爱儒.组织细胞一氧化氮及其合成酶测定的几种方法.北京医科大学学报，1994，26(增刊)：225.4张新波，黄海鹭，张灵芝，等.NOS活性测定及其应用.北京医科大学学报，1994，26(增刊)：173.5汤旭磊，曾正陪，张锐强，等.人肾上腺和肾上腺肿瘤组织的内皮素受体.中华内科杂志，1996，35(7)：462.6Lopez JJ,Beverly HL,Julie Rl,et al.Distribution and function of cardiac angiotension