体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展

1、体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展         08-07-01 10:53:00     作者：孙天威 张学利    编辑：studa20体外构建组织工程软骨的首要问题是种子细胞的来源，目前获得种子细胞的可能途径主要有以下几种：(1)培养扩增自体获得的软骨细胞；(2)同种异体软骨细胞；(3)骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞；(4)胚胎干细胞；(5)基因修饰细胞。本文就当前体外构建组织工程软骨的种子细胞研究进展综述如下：

2、60;   1  自体软骨细胞    自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分，是终末分化细胞，具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天或者数周内会持续表达其特异细胞表型1，使其成为软骨缺损关节的“细胞治疗”中合适的细胞类型。    使用标准化的有效培养方式培养软骨细胞，年轻人群的关节软骨细胞每天仅倍增0.3倍；年龄较大患者的关节软骨细胞的增生速度更低。当软骨细胞在非三维环境中培养

3、时，经过一段时间后(一般是3代以后)，它们的细胞表型会发生变化，发生“去分化现象”，表现得更像成纤维细胞的形态，表达型、型胶原，不再表达型胶原。    软骨“去分化”过程与培养条件相关。低密度接种和一些特定生长因子会促进培养的软骨细胞表达成纤维样细胞形态及相关蛋白2。另一方面，一些特殊培养条件会促进“去分化”的软骨细胞“再分化”，恢复软骨细胞特异的生物学行为。这些特殊的培养条件包括：旋转瓶培养；高密度微团培养；高密度和悬浮培养方法，能获得形态与功能都很稳定的软骨细胞；低氧培养；固态基质支架培养，例如将细胞接种到琼脂糖上、胶原或者藻酸盐凝胶培养。软骨组织工程中将软骨

4、细胞接种在一些海绵状载体支架上培养，可以维持软骨细胞表型3。不同的细胞因子对软骨细胞特异分子的表达影响不同。转化生长因子(TGF)超家族中的成员能够诱发体外培养的软骨细胞表达软骨细胞表型3。星型包菌素(Staurosporine)一种蛋白激酶C抑制剂，与胰岛素样生长因子(IGF)联合应用胰岛素，或单独应用IGF，肝细胞生长因子(HGF)，和成纤维细胞生长因子(FGF)都能够促进软骨特异性细胞外基质产物的表达5。    应用自体软骨细胞会造成供体部位的损伤，供体软骨部位的相关研究目前尚未见文章报道。为了获得健康软骨组织，分离软骨细胞，需要额外的手术，但易带来手术相关

5、的并发症，如感染、疼痛等。    2  同种异体软骨细胞    同种异体软骨组织作为一种移植物来源，因其独特的结构和免疫学特性，而引起研究者和临床医生的兴趣。组织学方面，软骨组织内部无血管、淋巴管和神经，其营养靠软骨基质的可渗透性从组织液中获得。软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，软骨囊成为其天然屏障，可阻挡免疫细胞直接侵入；软骨组织具有抗原性弱、不易被机体免疫系统攻击和排斥等特点10。因此同种异体软骨细胞是一种值得研究的种子细胞。Wakitani即于1989年以同种异体软骨细胞组织工程化技术成功修复了兔关节软骨表面缺损6。大量研究

6、结果已经证明7，同种异体软骨细胞可在受体内长期生长并保持分泌基质的功能，这为应用组织工程技术预制同种异体软骨组织提供了可能。同种异体来源的软骨细胞具有来源广泛、取材容易、一次可获取大量细胞、并且在三维培养环境和或生长因子作用下可保持软骨细胞的生理特性等特点。        近年来对于胚胎来源的软骨细胞研究较多。且动物实验及多种免疫学检查证实，胚胎来源的软骨细胞所形成的新生软骨比新生及成年动物来源的软骨细胞所形成的新生软骨在受体体内存留的时间要显著延长。胚胎软骨细胞的免疫原性比异体成年细胞大大降低，提示胚胎来源的软骨细胞可以作

7、为组织工程化软骨组织的一种种子细胞来源。        但是考虑到组织相关的免疫反应和疾病传播等方面的影响，同种异体软骨细胞用于治疗软骨缺损的方案缺乏足够的吸引力。    3  骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞        软骨细胞作为软骨缺损细胞治疗的种子细胞，在软骨细胞来源和体外培养条件下维持软骨细胞表型等方面有很多难题，目前尚难于解决。这引导人们研究其它类型的种子细胞。有些研究显示在体内和体外环境中，特定的

8、条件会诱发自体骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSC)、肌肉和脂肪组织来源的干细胞表达软骨细胞表型。骨髓基质干细胞以其来源充足、取材方便、创伤小、无排斥反应、增殖能力强、可大量培养扩增等优点，被公认有可能成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。目前诱导BMSC向软骨细胞转化的实验研究已取得成功8。高密度接种或者低氧条件培养以及一些特殊的生长因子会促进BMSC向软骨细胞方向分化。研究表明，将离心微球化(pellet)的BMSC在含有TGF无血清培养液中培养，2周左右即可获得富含细胞外基质的软骨细胞，组织学检查可见软骨细胞样陷窝9。同样，肌肉和脂肪组织来源的干细胞经体外

9、诱导均可表达软骨细胞表型。2003年Dragoo等证实将来源于人髌骨后脂肪垫的脂肪干细胞植入纤维蛋白胶，  经成软骨诱导后，在体外和裸鼠体内都出现成软骨的表型，有透明软骨形成。该研究提示以人脂肪干细胞为基础的软骨工程有可能在临床上用于治疗软骨缺损10。此外，激素类物质，如地塞米松、生长激素、甲状旁腺素、性激素以及维生素等都对骨髓间充质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞向软骨细胞转化有诱导作用。对生长因子的作用以及生长因子与全身激素类物质之间的协同或拮抗调控方式和调控机制的进一步研究，有望使骨髓基质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞转化的软骨细胞，早日成为软骨组织工程的充裕的种子细胞来

10、源。但是这种细胞有一种明显的缺点，他们会进一步分化成肥大软骨细胞，甚至发生磷酸类无机物矿物质沉积和软骨内钙化11。    4  胚胎干细胞        种子细胞的老化是组织工程中的一大难题。一些分化和增殖能力  强的原始细胞，即干细胞，是解决这一难题的希望所在。目前研究较  多的是骨髓基质干细胞，而胚胎干细胞因其具有全能性和无限增殖的  能力，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。胚胎干细胞是从着床  前胚胎(孕35 d)的内细胞团中分离所得，在体外进行培养的一种高  度未分化的细胞。目前大部分胚胎干细胞诱导软骨细