低剂量照射治疗免疫介导性再生障碍性贫血的实验研究

1、低剂量照射治疗免疫介导性再生障碍性贫血的实验研究         08-03-04 14:07:00     编辑：studa20                 作者：刘洪涛,赵钧铭,褚建新【摘要】  免疫介导性再生障碍性贫血（immunomediated aplastic anemia, IMAA）时淋巴

2、细胞处于激活状态，被抑制的造血干细胞处于静止状态，据此本研究探讨一项新的治疗IMAA的策略，即利用激活的淋巴细胞和静止的造血干细胞对放射敏感性的差异，给IMAA小鼠低剂量全身照射，此低剂量照射既可杀灭免疫活性淋巴细胞，解除它对造血干细胞的抑制，又不损害造血干细胞，从而使造血得以恢复。实验应用免疫介导性再生障碍性贫血小鼠模型完成，于造模后第4天全身照射150 cGy，以不治疗照射组和单纯照射组小鼠为对照，观察各组小鼠生存时间和生存率、血象和骨髓有核细胞数、骨髓和淋巴组织的病理形态改变。结果表明： IMAA组小鼠活存率为12.5%，平均存活时间为27.4±13.4天，照射治疗组活存率为1

3、00%，平均存活时间60天以上，单纯照射组无死亡；外周血白细胞数： IMAA组呈进行性下降，直至死亡，照射治疗组第10天与免疫再障组相似，以后开始缓慢回升，基本上达到治疗前水平；红细胞比容：未治疗IMAA组于14天后呈进行性降低, 至第35天比实验前减低2/3，照射治疗组与单纯照射组一样，第14天有轻度减低随后升高，至35天接近正常；骨髓有核细胞数： IMAA组呈进行性减低，无恢复趋势，照射治疗组于一过性减低后迅速增加，第28天达到正常水平；骨髓和淋巴组织病理形态观察： IMAA组小鼠呈典型再生障碍性贫血病理改变，骨髓造血衰竭，脾脏明显萎缩，而照射治疗组于第28天骨髓和脾淋巴脏组织基本上恢复正

4、常。结论：低剂量全身照射对IMAA小鼠有明显的治疗作用，骨髓和淋巴组织完全恢复；其疗效机制可能与低剂量照射杀灭免疫活性淋巴细胞解除了对造血干细胞的抑制有关。本研究结果不仅为免疫介导性再生障碍性贫血提出了一种新的治疗对策，而且为免疫介导性再生障碍性贫血机制的研究提供了新线索，在文献中尚未见有类似报道。 【关键词】  低剂量照射免疫介导性再生障碍性贫血 小鼠免疫活性细胞Experimental Study of Low Dose Irradiation for Treatment of ImmunoMediated Aplastic Anemia  in Mice &

5、#160;      Abstract    As the lymphocytes of immunomediated aplastic anemia (IMAA) are  in active state, and the hematopoietic stem cells are  in silence, this study was aimed to design a new strategy to treat IMAA. To utilize the  difference of

6、 radiosensitivity between  active lymphocytes and silent hematopoietic stem cells, the animals suffered from IMAA were treated with a single low dose of irradiation,  killing the active lymphocytes to release its suppression to hematopoietic stem cells  without injuring the hematopoie

7、tic stem cells. Therefore, the hematopoiesis can be restored. Experiments were completed in IMAA mouse model. At day 4  after making IMAA, the  model mice  were giren total body irradiation of 150 cGy, the nontreated model mice and normal mice irradiated  with 150 cGy were used a

8、s control. The survive time and survive rate of mice, blood picture, the account of nucleated cell of bone marrow, and pathological changes of bone marrow and lymphoid tissues of each group mice were observed. The results were as follows: (1) Survive rate of IMAA mice in nontreated group was 12.5%,

9、the average survive time was 27.4±13.4 days. 100% of IMAA mice in irradiationtreated group survived over 60 days. The mice of irradiation control group all survived. (2) The account of WBC of IMAA mice in nontreated group dramatically decreased until to die, and in the irradiationtreated group

10、it was gradually increased since  the 10th day after treatment and close to normal level at the 28th day. (3) The RBC hematocrit of IMAA mice in nontreated group progressively  decreased at  day 14, and IMAA mice of irradiationtreated group gradually recovered closely to normal level

11、after slightly fall at  day  14, similar  to the mice of irradiation control group. (4) The account of nucleated cells of bone marrow in nontreated IMAA mice dramatically decreased, and in the IMAA mice of the irradiationtreated group it was rapidly increased following transient fall,

12、 and restored to normal. (5) Pathological obser vations showed that the bone  marrow and spleen of nontreated IMAA mice demonstrated typical aplastic anemia pattern, including bone marrow  failure,   marked  splenatrophy, but  the bone marrow and  lymphoid tissues

13、in the IMAA mice of irradiationtreated group were  recovered to normal at  day 28  after treatment.  It  is concluded that the  low dose of  irradiation displayed a significant therapeutic effect to IMAA mice, their hematopoisis could  be  completely rest

14、ored to normal. The mechanism of therapeutic effect may contribute to low dose of irradiation killing the immunocompetent lymphocytes,  therefore,  suppressing  hematopoiesis. The experiment results not only set up  a new strategy for IMAA treatment, but also provided a clue to s

15、tudy the mechanism of IMAA.    Key wards    low dose irradiation; immunomediated aplastic anemia; immunocompetent   lymphocytes       中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(3)低剂量照射治疗免疫性再生障碍性贫血的实验研究    近年来的研究证明，免疫介导性

16、再生障碍性贫血（immunomediated aplastic anemia, IMAA)的骨髓造血干细胞的质量无明显异常，主要是T淋巴细胞数量与功能的异常，以及异常T细胞克隆的产生。这些异常改变在IMAA发生发展中起重要作用1-5。采用免疫抑制治疗对于这种类型的AA具有明显的治疗效果 6-8，但免疫抑制剂的副作用较大，例如应用疗效较好的抗胸腺球蛋白，患者也常因高热不退而难以坚持治疗。    本研究根据IMAA发生的机制，即淋巴细胞（主要为T淋巴细胞）处于激活状态，直接或产生淋巴因子间接地对造血干细胞产生负调控作用，从而导致骨髓各系造血细胞减少。也就是说，在IMA

17、A发生过程中，免疫淋巴细胞处于激活状态，造血干细胞处于抑制或静止状态。众所周知，淋巴细胞，特别是激活状态的淋巴细胞对辐射比较敏感，而处于抑制或静止状态的造血干细胞对辐射不甚敏感。本研究利用淋巴细胞与造血干细胞对放射敏感性的差异提出了一项治疗IMAA的新设想，即选择适当的放射剂量对免疫再生障碍性贫血小鼠进行全身照射，一方面杀灭或抑制激活的淋巴细胞，解除其对造血干细胞的负性调控作用，另一方面又不至损伤骨髓造血干细胞，使造血干细胞能增殖和分化，恢复正常造血功能，达到治疗免疫再障的目的。    为了验证这一设想，我们以IMAA小鼠为模型，探讨了不同放射剂量和不同治疗时间的

18、效应，最终确定了造模后第4天全身照射150 cGy作为治疗方案，并获得了理想的实验结果。经放射治疗的IMAA小鼠的存活率达到100，生存时间在60天以上。本研究为探讨IMAA治疗提供一种新的治疗途径，在国内外文献中尚未见有类似报道。    材料和方法    实验动物    受体小鼠：BALB/c小鼠（H2d，MLSb），8-12周龄，20-25 g，雌性。    供体小鼠：DBA/2小鼠（H2d，MLSa），6-14周龄，18-20 g，雌雄兼用；作为淋巴细胞供者。上述两种小

19、鼠均购自北京中国医科院实验动物研究所。    试剂    Hanks液，白细胞分离液，小鼠CD3、CD4、CD8单克隆抗体，NH4Cl Tris液，台盼蓝等均由中国医学科学院血液学研究所实验病理室和免疫室提供。    照射条件    采用铯源 射线照射 （Gammacell Canada），剂量率为89.2 cGy/min，对实验小鼠进行全身照射。    胸腺淋巴结细胞悬液制备    将DBA/2小鼠断颈处死后，在无

20、菌条件下取出胸腺和肠系膜淋巴结，分别剪碎、冲洗、4号针头抽吸，使之成为单细胞悬液。经台盼蓝拒染试验，活性细胞为95%以上；将胸腺与淋巴结细胞按12混合，配制成浓度为5×106/ml的淋巴细胞混合液，4保存待用。    小鼠IMAA模型的建立    依照姚军等9并参考周永明等10的方法稍加改进，受体BALB/c小鼠全身照射剂量由600 cGy改为500 cGy，于照射后4小时内经尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴结的混合细胞，细胞数为1×106/只，AA小鼠发病率为100%，生存时间比姚军等的实验结果明显延长，有利于观察本实验治疗方案的疗效。    实验方案和分组    单纯照射组  18只小鼠，9只观察生存期，9只动态活杀检测。BALB/c小鼠全身照射500 cGy，不作任何处理。    IMAA模型组  17只小鼠，8只观察生存期，9只动态活杀检测。BALB/c小鼠经500 cGy全身照射后4小时内，经尾静脉注射DBA/2小鼠的胸腺淋巴结混合细胞悬液（1×