青岛大学大学生创新创业训练计划项目

1、青岛大学大学生创新创业训练计划项目季度检查报告 2019 年 7 月 8 日项目名称淫羊藿素抗AD炎症反应的药效评价及机制研究项目编号G201811065068项目级别国家级学院（部）医学部基础医学院负责人(姓名/学号)黄琳琳 2016210316指导教师陈文芳其他成员(姓名/学号)郑欣慧 2016210301伏慧敏 2016210260 刘慧 2016210213徐蒙莉 2016210263一、项目进展情况及取得成果（按照项目研究工作计划逐一对照填写）项目进展情况（ ）按计划进行、（ ）进度提前、（ ）进度滞后主要研究阶段(起止时间)研究内容完成情况2018.07-2018.11不同浓度淫羊

2、藿素（ICT）对LPS诱导的海马区小胶质细胞激活产生的炎性反应的保护作用已完成2018.12-2019.04GPER信号通路是否参与了ICT的抗炎机制已完成2019.04-2019.10利用免疫印记、免疫组化等方法进一步验证GPER是ICT抗炎作用的靶点且探究其下游信号通路已部分完成项目研究成果（已取得的成果）序号项目成果名称成果形式1234二、项目中期报告（项目执行的进展情况，取得了哪些成绩，是否达到预期效果，以及在项目的开展过程中还存在哪些问题。）1.第一阶段：淫羊藿素 (ICT) 对LPS诱导的AD小鼠炎症模型的保护作用(1)进展： 选用8周龄左右的雄性ICR小鼠，适应性喂养一周后，应用

3、脑立体定位，将脂多糖 (LPS) 2.5ul注入小鼠右侧侧脑室，制备AD炎症模型。注射坐标为：前囟 (AP)，-0.1mm;旁开 (ML)，-1mm;深度(DV)，-3mm。造模完成后，连续灌胃给药ICT12天，并在灌胃给药第8天起，连续5天进行水迷宫检测，观察其学习记忆能力。而后取出左右侧海马组织，检测炎性因子TNF-、IL-1和炎性因子限速酶COX-2、iNOS的基因表达，观察不同浓度的ICT（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg）对炎症反应的保护作用,选出最佳保护剂量。(2)结果：水迷宫结果显示，与Control组相比，LPS模型组小鼠的潜伏期增加、目的象限时间比及平台穿越次数减

4、少（P<0.001）；Real time PCR结果显示，LPS模型组海马区炎性因子IL-1、TNF-及炎性因子限速酶iNOS、COX-2的基因表达上升（P<0.001，P<0.05）；不同剂量的ICT（5mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kg）对LPS均有不同程度的保护作用，能够明显降低小鼠的潜伏期、增加目的象限时间比及平台穿越次数（P<0.01，P<0.05）（见图1），降低炎性因子的基因表达（P<0.001， P<0.01，P<0.05）（见图2），其中10mg/kgICT组对LPS诱导的炎性反应的抑制作用最明显。 图1 不同剂量I

5、CT对LPS诱导的小鼠学习记忆能力损伤的保护作用Fig. 1 Protective effects of different dosage of ICT against LPS-induced learning and memory ability deficits in mice After LPS injection, different dosages of ICT were administered by intragastric (i.g.) for 12 consecutive days. On the 7th day, performing 5 days of water maz

6、e training and testing. Data represent the mean±SEM, n=6. *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.01compared with the LPS group.图2 不同剂量ICT对LPS诱导的海马区TNF、IL-1、COX-2及iNOS基因表达的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effects of different dosages of ICT on LPS-induced gene expressions of TNF、I

7、L-1、COX-2 and iNOS in hippocampusAfter the water maze experiment completed, taking the right hippocampus for RT-PCR experiment, detect to gene expression of TNF、IL-1、COX-2 and iNOS. Data represent the mean ± SEM, n=6. *P<0.05, *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.

8、01, #P<0.001 compared with the LPS group.2.第二阶段：GPER参与ICT抗炎机制的初步研究（1）进展：将小鼠随机分为5组，分别为对照组，LPS组，LPS+ICT组，LPS+ICT+G15组， LPS+G15组。LPS造模完成后，侧脑室埋管。随后每天在灌胃ICT 1h前通过埋管位置注射GPER的特异性阻断剂G15，连续12天。同样进行水迷宫实验，检测不同处理组小鼠的学习记忆能力，然后断头取脑，应用实时定量PCR技术检测小鼠COX-2，iNOS的基因表达。（2）结果：与ICT给药组相比，G15+ICT组小鼠的水迷宫实验其潜伏期明显增加、目的象限时间比

9、及平台穿越次数减少（P<0.05）（见图3）；海马区炎性因子限速酶 COX-2、iNOS的基因表达均增加（P<0.01，P<0.05）（见图4）。此外，G15+LPS组与LPS组相比，以上各指标均无明显差异。图3 GPER的特异性阻断剂G15 对ICT改善AD小鼠学习记忆能力的阻断作用Fig.3 The blocking effects of G15 on ICT-improved learning and memory ability in AD miceAfter LPS injection, ICT was administered intragastrically e

10、very day after injection of G15 for 12 consecutive days. On the 7th day, performing 5 days of water maze training and testing. Data represent the mean ± SEM, n=6. *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.001 compared with the LPS group, P<0.05 compared with the 10mg/k

11、g ICT + LPS group.图4 GPER的特异性阻断剂G15 对ICT抑制炎性因子iNOS和COX-2基因表达的阻断作用Fig.4 ICT inhibited the gene expressions of iNOS and COX-2 via GPER in hippocampusAfter the water maze experiment completed, taking the right hippocampus for RT-PCR experiment, detect to gene expression of COX-2 and iNOS. Data represen

12、t the mean ± SEM, n=6. *P<0.05, *P<0.001 compared with the control group, #P<0.05, #P<0.01, compared with the LPS group, P<0.05, P<0.01 compared with the 10mg/kg ICT + LPS group.3. 第三阶段：利用免疫印记、免疫组化等方法进一步验证GPER是ICT抗炎作用的靶点（1）实验方法：利用上述五组小鼠海马组织，应用Western-blot技术，检测海马内炎性因子iNOS及COX-2

13、的蛋白表达。（2）结果Western blot结果显示ICT可以抑制LPS诱导的COX-2及iNOS的蛋白表达（P<0.001）；与LPS+ICT组相比，G15+ICT组小鼠海马区的COX-2及iNOS的蛋白表达均增加（P<0.01，P<0.001），表明ICT的抗炎保护作用可以被G15所阻断。此外，G15+LPS组与LPS组相比，以上各指标均无明显差异（如图5）。图5 GPER介导ICT对AD小鼠海马区炎性因子蛋白表达的抑制作用3.预期效果：上述实验结果达到预期效果，接下来按计划进行后续实验。三、经费使用明细情况项目获批总经费： 10000 元已使用项目研究经费： 6000 元已报销金额： 0 元未报销金额： 6000 元项目经费开支情况名目用途金额备注论文版面费专利申请费调研、差旅费打印、复印费 资料费试剂等耗材费实验用材料，抗体，PCR反转录试剂盒等4000元器件、软硬件测试、小型硬件购置费购买实验老鼠等2000