微生物的适应性进化

1、微生物的适应性进化 适应进化又称定向进化 " 实验室进化或驯化，是目前备受瞩目的菌种改良技 术 ，能够使菌株在较短的时间内有效地改变菌株的某些表型或生理特性（如菌 体生长速度，底物消耗速度，耐受高温高低pH值以及不同有机溶剂等），并且 基本不会影响除目的表型外的其他优良性状。 目前实验室最常用的适应进化方法 是在特定条件 （给予选择压力） 下将微生物连续传代培养， 通过菌株自发突变的 不断富集，获得适应特定条件的表型或生理性能 。在微生物进化过程中， 选择压力的存在可以保证微生物在与选择压力的相互 作用下， 菌种的随机变异实现定向淘汰， 与环境相适应的基因型得以保存， 特别 是在人工

2、选育过程中， 通过人工施加定向的选择压力， 使微生物沿着所需的方向 的进化，从而获得目标性状的菌种。 乙酸作为细胞毒素经常在很多生物过程中作 为副产物不断积累，乙酸浓度逐渐升高的环境压力存在于许多工业微生物领域。 以生物乙醇的生产为例，副产物乙酸会严重抑制乙醇的生产， Peter Steiner 等 人将不耐受乙酸的野生型 Acetobacter aceti进行适应性进化实验，将逐渐提高浓度的乙酸作为选择压力， 经过 240 代的适应性进化， 获得了能够耐受 50g/L 浓度的乙酸的菌株。 Hillesland 和 Stahl 首次将脱硫弧菌和产甲烷菌混合培养 300 代来研究混菌体系的进化历

3、程， 脱硫弧菌为产甲烷菌提供氢离子， 产甲烷菌 通过消耗氢离子为脱硫弧菌提供适宜生存的条件， 两者通过代谢产物的交流实现 专性的互利关系。 虽然两种菌株都是从共生微生物体系中分离， 但是它们是从不 同的环境中分离出来， 而且单独培养。 将这一严格互利共生的混菌体系进行适应 性进化实验，其实验核心就是将体系中的一种微生物作为另一微生物的选择压力 进行了实验设计， 这种生物选择压力的存在能够使适应彼此物质代谢交流的菌种 得以保存和扩大种群优势，进化后的混菌体系生长速率提高了80%，生物量提高了 30%。单菌多次级代谢产物策略在 “沉默代谢途径”的应用 在非自然条件下，微生物中很多编码次级代谢产物的

4、基因簇是保持沉默的。 在细菌和真菌中有关次级代谢产物合成的基因簇数目远远大于实验室条件下实 际合成的天然产物的数目 29。毫无疑问，这些沉默的基因簇是发现活性药物组 分的巨大资源库， 如何激活这些未表达或者表达量比较低沉默基因将是我发现新化合物的一种重要途径。早期的发酵科学就发现培养基的改变会影响微生物次级代谢产物的数量及 质量培养基微小的变化不仅能影响到主代谢产物，甚至能影响微生物代谢产物的类型，在单菌多次级代谢产物（One strain many compound§ OSMAC）策略的指导 下，通常采用改变培养基，添加微量元素、前体化合物或酶抑制剂等，以及改变 培养条件等方法实现

5、增加化合物种类和数量的目的。通过基因组学的研究同样表明由于在实验室单一或者相近的培养条件下，微生物中存在大量常规培养条件下未表达的代谢途径，叫着“沉默代谢途径”，进而造成微生物资源的浪费。改变微生物生长的微环境可以激活菌株的“沉默代谢 途径”提高微生物次级代谢产物的多样性。德国Gott in gen大学的Zeeck小组提出了单菌多次级代谢产物（One strain many compounds OSMA（策略，并对微生 物株放线菌、的培养基，培养条件，添加前体或酶抑制剂等方法进行了研究，共 获得了 25类100余个化合物昭，许多化合物是传统培养方法无法获得的。Sarkar 等研究了模式真菌A.

6、nidulans在恒化器中连续发酵，通过维持微生物较慢的生 长速度,改变培养基中硝酸盐（N源）,磷酸盐（P源）,葡萄糖（C源）等成分的浓度, 发现两个原本沉默的聚酮合酶基因表达出了9个多酚类化合物。其中一个新化合物是烯化的苯甲酮衍生物（preshamixa nth on e）,可能是氧杂蒽酮代谢途径的一个 中间体,表明不同的培养条件可以诱导沉默的聚酮合基因表达昭。Russell等在枝抱芽枝菌（Cladosporium cladosporioides）培养基 中加入微生物表观遗传调控剂DNA甲基化酶抑制剂-5-azacytidine（氮杂胞苷）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂-suberoyla nil

7、ide hydroxamic acid（SAHA），并分析和分离了发酵液的次级代谢产物，结果显示两种表观遗传调控剂可以产生不同的次级代谢产物，加入 5-azacytidine能够产生羟脂类化合物，而加入SAHA后能够产生7个二萘嵌苯醌类化合物，其中2个是新化合物34。研究表明拟茎点菌属Phomopsis sp.的一些菌株能够产生具有生物活性的二 苯并吡喃酮35， Phomopsidin类化合物昭。Christian OE 37等所采集的同属天 门冬拟茎点菌Phomopsis asparagi在实验室海水培养基的条件下并没有产生上 述标志性的化合物，因此采取了 （One strain many

8、compounds OSMA（策略，通 过加入促微丝聚合剂，得到了一系列 Chaetoglobosins类化合物。Schiewe hJ38 等通过改变培养瓶及通气条件，从链霉菌属 G? 40/10 菌株的代谢产物中分离得 到一系列化合物，并证明由于培养基的改变， 之前沉默的生物合成基因簇被打开， 出现了新的生合成路径。Jens等39-40研究发现赭曲霉属DSM7428菌株在常规培养条件下，只得到了 一种化合物，且产量较低，通过采用 （One strain manycompounds OSMA（策略， 改变培养条件， 如使用不同的培养瓶， 改用静态培养等方法， 使化合物产量由原 来的8mg/L提

9、高至94mg/L,并且产生了丰富的产物（14种）。海洋真菌Libertella sp 与细菌 a-proteobacterium 联合培养后，得到了分别培养所没有得到的化合 物，这些化合物对白色念珠菌仅有微弱的抗菌活性，但是对人结肠癌 H（T-116 具有较强的细胞毒活性 41 。这些研究均表明通过改变微生物的培养条件， 能够诱 导微生物次级代谢产物新的合成途径， 是发现新的天然产物的有效手段， 并且由 此提出了（One strain many compounds ， OSMA（理论，为深入开发放线菌天然 产物提供了切实可行的新思路。N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine）

10、是链霉菌初级代谢中 C源和N源主 要来源之一，天蓝色链霉菌相对于葡萄糖也更偏好于利用N-乙醜葡萄糖胺作为碳源,N-乙酰葡萄糖胺也是细胞壁肽聚糖的主要组分之一。在富营养培养基（如R2YE）中,N-乙酷葡萄糖胺完全阻断天蓝色链霉菌菌丝体生长以及抗生素产生，在寡营养培养基（如MM中却又能刺激天蓝色链霉菌产生抗生素和形成抱子。研究 发现导致这种现象的原因是由全局性调控因子GntR家族DasR蛋白介导调控N-乙酰葡萄糖胺的代谢以及抗生素的合成。N-乙酰葡萄糖胺主要有两个来源，一个是富营养培养基中几丁质的分解 ,另一个是营养菌丝中细胞壁的降解。细胞壁的 降解造成了 N-乙酰葡萄糖胺的大量积累，经过一系列的

11、酶促反应之后生成了6-酸葡萄糖胺,6-酸葡萄糖胺作为配体致使抑制蛋白 DasR从actll-0RF4和redZ 的启动子上脱离 , 由其阻遏的 actinorhodin （Act） 和 undecylprodigbsin （Red） 基因簇得以激活表达 42 。因此,6- 磷酸葡萄糖胺信号通路的发现 , 不仅在分子水 平上揭示了链霉菌生长分化和次级代谢之间的联系 , 也为激活链霉菌次级代谢基 因簇开辟了一条新的途径。莽草酸是芳香族氨基酸生物合成途径 （又称莽草酸途径 ）的中间代谢产物 ,其 生物合成与磷酸戊糖途径生成的四碳糖有关。磷酸戊糖途径的中间产物赤醉糖-4- 磷酸和糖酵解过程的中间产物磷

12、酸烯醇式丙酮酸 , 在醛缩酶的作用下缩合形 成3-脱氧-n-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸,经过脱氨奎尼酸合酶脱磷酸环化形成5-脱氢奎尼酸 , 在 5-脱氢奎尼酸脱水酶的作用下脱水生成 5-脱氢莽草酸 , 最后加氢 后形成莽草酸。 Kimberlee K 等43 、DJ wilson 等44 研究发现莽草酸经脱水、加 氢、电子重排等反应生成 3,4- 二轻基环己烷羧酸 , 后者是子囊霉素生物合成的起 始单位。 3,4- 二轻基环己烷羧酸 C-4 位甲基化发生在子囊霉素组装基本完成后 43 。雷帕霉素中环己烷羧酸部分的生物合成过程与子囊霉素中环己烷羧酸部分合 成过程相同,都来源于莽草酸。ChengYR

13、等研究了雷帕霉素合成中L-外源苯丙氨 酸的添加反馈抑制了雷帕霉素起始单元环己烷的来源-莽草酸的合成 45 。营养学研究也表明 57mmol/L 外源莽草酸能刺激雷帕霉素的生物合成 , 比对照产量增加 125%46。微生物只有在适宜的环境条件下才能正常生长繁殖。 在发酵生产中，除培 养基成分及其浓度外，只有环境条件能够被直接调控，发酵过程中的温度， pH 值，溶氧，金属离子，表面活性剂等变量都能够对微生物的繁殖，代谢活动造成 影响，因此可以通过发酵条件的调控来使次级代谢产物产物的量增加或者得到新 的次级代谢产物。温度对微生物的影响是多方面的， 不仅影响微生物的生长繁殖， 而且也影响 到微生物的代

14、谢，温度对产物合成的影响在过程优化中温度对生长和生产的影响 是不同的，一般发酵温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。 但酶本身很易因过热而失去活性， 表现在菌体容易衰老， 发酵周期缩短， 影响最 终产量。温度除了直接影响过程的各种反应速率外， 还通过改变发酵液的物理性 质，例如， 氧的溶解度和基质的传质速率以及菌对养分的分解和吸收速率， 间接 影响产物的合成。 温度还会影响生物合成的方向， 例如， 四环素发酵中金色链霉 菌同时能生产金霉素，在低于30°C,合成金霉素的能力较强。合成四环素的比例 随温度的升高而增大，在 35C时只产生四环素旳。本研究为了考察不同温度对 T

15、RM40136次级代谢产物的影响设计了以下：23C、28C、30C、27C、41 C五个不同温度来研究。 不同菌种及同一菌种的不同发酵阶段， 菌体的需氧量是不同 的，发酵液中的溶氧浓度会直接影响微生物酶的活性及代谢途径， 进而影响菌体 的生长和代谢产物的积累，并最终决定产量的高低48。徐庆阳49等以L-苏氨酸生产菌TRFC为菌种发酵生产苏氨酸，考察了不同溶氧水平对L-苏氨酸合成的影 响。其结果表明，供氧充足、菌体呼吸旺盛可保持较快的生长速率，此外，L-苏氨酸的前体物草酰乙酸主要由对氧浓度要求较高的TCA循环和磷酸烯醇丙酮酸羧化反应提供， 充分供氧可使菌体呼吸充足， 有利于产酸和糖酸转化。 本研

16、究 为了考察不同装液量对 TRM4013次级代谢产物的影响设计了以下：50ml/500ml， 100ml/500ml， 150ml/500ml， 200ml/500ml， 250ml/500ml 五种装液量来研究。 pH 对微生物的生命活动有很大的影响 , 主要通过几个方面实现 :一是使蛋白质、 核 酸等生物大分子所带电荷发生变化 , 从而影响其生物活性 ; 二是引起细胞膜电荷 变化, 导致微生物细胞吸收营养物质能力改变 ;其三是改变环境中营养物质的可 给性及有害物质的毒性不同微生物对pH条件的要求各不相同，它们只能在一定 的pH范围内生长,这个pH范围有宽、有窄,而其生长最适pH常限于一个较窄的 范围,对pH条件的不同要求在一定程度上反映出微生物对环境的适应能力50。本研究为了考察不同pH值对TRM4013欲级代谢产物的影响设计了以下：pH=5、 pH=6、pH=7、pH=8、pH=9五种pH进行发酵研究。微生物在生长和繁殖过程 中需要一些微量元素作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物质 ,而 且这些微量元素一般在一定的浓度范围内才对微生物的生长和产物合成有促进 作用51-53。本研究通过在培养基中添加不同浓度的金属离子Mg2+、Ca 2+、Cu 2+、Mn2+、Zn 2+、Fc 2+等，来考察它们