全血分析白细胞-血小板粘附

1、全血分析白细胞-血小板粘附当血管受到损伤时,血小板通过迅速形成血栓在止血反应中起重要作用。在炎症和血栓性疾病中，血小板会与循环血中的白细胞粘附，特别是与单核细胞和粒细胞。血小板与单核细胞和粒细胞的粘附是通过血小板脱颗粒活化后表面表达P选择素完成的。P选择素进而与表达在白细胞表面的PSGL-1（P选择素蛋白受体1，也称CD162）结合。随后白细胞-血小板聚集物形成（Leukocyte-PlateletAggregates LPAs），并且聚集体通过多种机制稳定持续下去，其中包括白细胞Mac-1(CD11b/CD18)与血小板糖蛋白（GP）Ib的结合。循环血中单核细胞-血小板粘附已被证明是一种较体

2、内血小板表面P选择素表达更为敏感的指标。尽管细胞之间的反应过程是相当复杂的，但用流式细胞仪检测全血中LPAs则相对简单。虽然检测低表达的P选择素相当困难，但低水平的P选择表达便能启动与白细胞的粘附过程。当血小板与白细胞粘附形成后，可通过足够的血小板特异性标记便轻易地将它们检测出来。流式细胞仪通过光散射信号和白细胞特异性试剂，如CD14，设门圈出白细胞并分析LPAs。通过第二个标志来识别血小板，如CD41 (GPIIb), CD61 (GPIIIa),或 CD42a (GPIX)，可区分出高表达CD41,CD61, 和 CD42a 的血小板颗粒。血小板颗粒的大小异质性比较大（直径1至5um），并

3、且血小板形成的微颗粒platelet-derived microparticles (PDMP)也表达P选择素，这就可解释为什么会出现比同型对照荧光稍强的血小板阳性白细胞。这种类型的LPAs不应被忽视，因为循环PDMP经常与临床疾病状态有相关性。在此推荐阅读6.10章节，因为其中许多重要注意点也同样在循环LPA检测十分重要。比如，抗凝剂的选择与全血样本的处理同样会影响LPAs的分析。可靠的样本处理过程对于检测的敏感度也十分重要，同时体外引起的血小板活化也会引起非特异性的LPAs的数量增加。基本方案全血分析白细胞-血小板聚集单核细胞和粒细胞可通过FS/SS参数识别出来，但使用特异性白细胞抗体可增

4、加识别精度。血小板与血小板的粘附也会影响光散射设门方案，特别是对单核细胞群体的影响。鉴于以上原因，我们推荐在使用抗血小板抗体以外再使用抗白细胞抗体。每个实验室必须自己滴定抗体来选择最佳抗体浓度与孵育时间。CD14是用来识别单核细胞最常用的抗体，尽管这个抗原会因细胞活化而表达降低或在不成熟细胞上呈弱表达。CD45阴性设门可有效去除非白细胞-血小板聚集物，但需注意的是要避免将大颗粒淋巴细胞与嗜细胞混入单核细胞门内。大颗粒淋巴细胞的光散射特征与单核细胞相似，但CD45着色要亮得多。嗜碱粒细胞CD45着色与单核细胞类，但它的光散射特征与淋巴细胞类似。因此，只有联合光散射与白细胞特异性标志物才能对单核细

5、胞进行最佳设门。中性粒细胞因为具有很高的侧向散射光信号，当与白细胞特异性标志物联合设门时遇到的问题较少。前向散射光对于设门淋巴细胞帮助不大，因为当血小板大小不一致，特别是在血小板活化后会干扰淋巴细胞。 血小板GPIIb-IIIa复合物（CD41/CD61）这个标志物经常被用来特异性地识别血小板，因为这个受体在血小板上高度表达（80,000/血小板）。选择抗体监测这个复合物时要多加注意，因为CD41/61是血小板一个重要的受体，它能与很多不同的粘附蛋白受体结合，这将可能影响正常的LPA的形成及其稳定性。还要注意的是CD42b它很容易受到蛋白水解酶的影响并且当血小板活化时CD42a和CD42b会下

6、调表达。推荐使用PE（藻红蛋白）荧光素作血小板特异抗体的标记物，因为这个荧光亮度很强与粒细胞自发荧光相比时它可显现出来。粒细胞的同型对照（包括粒细胞的自发荧光）会在FITC通道表现得十分强烈，经常会引起LPA直方图阳性区域设置错误。材料血小板特异性：抗-CD42a, -CD42b, -CD41, -CD61（这些抗原中一个或几个在一些稀有的遗传性疾病中会缺失，如Bernard-Soulier综合症和Glanzmann血小板功能不全）白细胞特异性标志物：单抗-CD14，-CD64, -CD33, 或 -CD45（这些抗体通常与血小板特异性抗体混在一起）阴性对照：使用亚型、荧光素、浓度一致的非特异

7、性抗体来确定荧光背景信号（需与血小板特异性抗体联合使用）血小板活化剂：可使用ADP或凝血酶受体-活化蛋白配方修改过的HEPES/Tyrodes缓冲液样本来源：人全血（病人或正常人）固定溶血剂：使用含有甲醛的红细胞裂解液，如FACS溶血剂，BD公司出品。使用含有柠檬酸钠或其他适当抗凝剂的采血管21-G(或更大号)的采血针头装备有488-nm激发光的流式细胞仪及相配套的滤光片用于收集荧光。注：不同的实验室应自己选用适当的检测条件及样本处理方法。1， 抽血前，在检测管中预先加入20 l的血小板特异性抗体（或同型对照抗体），20 l的白细胞特异性抗体，和20 l的血小板活化剂（或HT缓冲液），每个检测

8、管中共加入60 l的试剂。2.使用21-G（或更大号的）采血针并轻柔压血进行采血，采血后将血直接注入含有柠檬酸或其他适宜抗凝剂的收集管。确保血样平衡、缓慢流入样本管内，并弃用最初采集的2至5ml血液。3. 血样采集后20分钟内将20 l血样加入第1步制备的检测管中并轻轻混匀。室温下静置孵育15分钟。如要使用更高浓度的全血则要注意避免血小板聚集，这可能会影响光散射设门。4.加入800 l的固定/溶血剂并室温下孵育10分钟左右使得红细胞被裂解。4°C下储存样本。5.按照以下步骤使用流式细胞仪分析样本：a.以中速分析样本（见参数解析和故障解决章节）。因为在未经洗涤的样本中存在有高数量的血小

9、板，当样本以高流速分析时会增加白细胞-血小板的聚集。收集光散射信号时使用线性模式，并将阈值设在前向散射光上。最少收集1000个CD14阳性的单核细胞，它大概占总白细胞的2%-15%。b.建立一个侧向散射光与CD14（或其他白细胞标志物）荧光的双参数点图（见图1）。c.建立一个门圈定目标细胞群体（如：单核细胞或粒细胞）。d.为各个含有目标细胞的门建立直方图，如图2、3所示。e.根据未刺激样本的同型对照设定阳性区域。如图4、5所示。f.分析未刺激及经刺激过血小板样本。如图所示的TRAP刺激的细胞。g. 记录血小板标志物阳性的单核细胞或粒细胞的百分比。固定后的全血样本分析白细胞-血小板粘附尽管新鲜全

10、血经抗体染色后通常所得的检测结果最好，但在某些情况下需要将样本固定后再染色。对样本固定可延长血样采集到分析之间的时间。如果在操作过程中有一系列的时间要求，则固定操作可能是唯一的解决方法。病人样本可能会存在药物与单抗之间的反应，当运用固定方法后可避免此情况。此外，血小板对于体外的活化因素十分敏感，固定步骤可使样本停留在更接近于体内活化状态的水平上。许多抗体与福尔马林固定后的抗原结合浓度降低甚至消失。故每个实验室都要对固定后的样本滴定抗体效价。实验材料，见以上基本方案1. 在采血后20分钟内，室温下吸取200 l抗凝血至5-ml试管中加入2 ml固定溶血剂（如FACS）孵育10分钟。如果要研究活化

11、剂对血小板与白细胞粘附影响，则需要在固定前活化样本。2.加入3 ml HT缓冲液稀释样本并存储在4°C下。未稀释及固定的样本也可存储在4°C，并可在步骤3前进行稀释。如固定时间延长可能会影响抗体的染色效果。3.室温下以250 至 400 × g的速度离心要进行染色的样本五分钟。去上清后将细胞在400 l HT 缓冲液内重悬并轻轻混匀。4.重新准备试管，吸入40 l的以上样本加入20 l的白细胞特异性抗体和20 l的血小板特异性抗体或同型对照。室温下避光孵育15分钟。5.加入800 l的固定/溶血剂并存储在4°C条件下。6. 按照基本方案的第5步，在流式细

12、胞仪上分析样本。试剂和溶液在所有试剂配方中请都使用去离子水。GPRP, 10 mM在改良过HT缓冲液中溶解GPRP (Gly-Pro-Arg-Pro)浓度为10 mM。4°C下可存储1个星期，20°C条件下可存储1年。使有前请先恢复至室温。本溶液用于稀释凝血酶并因含有CaCl2可在检测中防止纤维蛋白聚合而形成凝块。改良的 HEPES/Tyrodes (HT) 缓冲液10 mM HEPES137 mM NaCl2.8 mM KCl1 mM MgCl212 mM NaHCO30.4 mM Na2HPO40.35% 牛血清白蛋白5.5 mM 葡萄糖用0.1 M NaOH 或 0.

13、1 M HCl调节pH值至7.4。4°C下可存储1个星期，20°C条件下可存储1年。使有前请先恢复至室温。4°C条件下存储后要重新调节pH值。血小板活化剂制备任何血小板活化剂时都需使用HT缓冲液来作为溶剂，使用前根据需要决定是否要加入6 mMCaCl2 。弃用所剩工作液。ADP:二磷酸腺典型的工作浓度为20 M（在稀释的全血中具有最大的活化效果）至0.5 M。根据生产商的使用说明来储存ADP（通常是在20°C冻存）。Collagen（胶原质）: 胶原质通常以10 至 20 g/ml的浓度单独使用或与较低浓度的凝血酶（见下）联合使用。使用改良后的补充了6

14、mM (2×) CaCl2的HT缓冲液进行稀释。当使用含2.5mM (终浓度) GPRP (见上配置 10 mM的处方)的胶原质时可用于检测促凝血型血小板和血小板形成的微颗粒。根据生产商的说明存储胶原质。Epinephrine肾上腺素:经常将10 至 20 M浓度的肾上腺素与ADP联用（在稀释全血中可获得最大活化效果）。根据生产商提供的说明书保存肾上腺素。Human -thrombin人凝血酶: 凝血酶的典型工作浓度为1 至 2 U/ml（在稀释的全血中可获得最佳活化效果），亚活化浓度为0.1U/ml。 在无血浆标本中，获得最佳活化效果的凝血酶浓度是0.1 U/ml左右。使用含10

15、mM GPRP（终浓度为2.5 mM）的改良HT缓冲液来稀释凝血酶。200 U/ml的凝血酶存储液可在80°C保存6个月以上或4°C保存1个星期。Thrombin receptor-activating peptide (TRAP/SFLLRN)（凝血酶受体活化缩氨酸）:使用改良的HT缓冲液稀释试剂。TRAP典型的工作浓度是20至50 M（在稀释全血中可获得最佳活化效），亚剂量为1.5至5 M。80°C冷冻保存，4°C下保存1个星期。使用前恢复至室温。说明背景知识使用血小板与单核细胞和粒细胞的粘附来反映血管损伤已有很长历史了。循环血中出现LPAs是一个涉

16、及血管初始状态、血管粘附、网状内皮系统抑制、白细胞活化到LPA通过粒细胞酶降解的动态过程。在稳定性冠状动脉疾病中、不稳定性心绞痛、急性心肌梗塞、慢性静脉循环不畅、心肺外循环都会造成循环血中LPA的增加。循环血中的LPA在冠状动脉搭桥术后也会增加。参数解析和故障解决为了避免血小板的自然活化，抽血时要干净利索并且在输送样本时要轻柔。如果在实验过程中加入了活化剂来研究细胞活化，则可能会形成血小板的粘附从而会干扰实验。这一点十分重要，所以在激活过程中要保证样本不被干扰，并且随后要立即固定样本。即使在不加入任可刺激活化剂的情况下，LPA会在血液被注入抗凝剂的瞬间形成；因此样本的整个处理过程要保证在20分

17、钟内完成而避免人为的LPA形成。大型的血小板聚集物会表现出很高的光散射特性，并可能会影响分析。但这些颗粒可以通过强阳性血小板标志物并弱阳性白细胞标志物的特异将之去除。EDTA抗凝的全血决不可用于LPA的分析实验，因为EDTA会在体外引起血小板与白细胞的分离。为了提高分析速度，所有的检测管都要在加入血样时作好标记并加好试剂。抗凝剂如CTAD（柠檬酸）或血小板活化拮抗剂，如环前列腺素或三磷酸腺苷双磷酸酶，可最大程度地抑制自发形成的LPA，但这些方法影响活化剂的作用并可能会降解已存在的LPA。样本不可置于<15°C的环境下，因为重新恢复温度造成血小脱颗粒并引起LPA的形成。使用基础方

18、案来精确计算LPA的比例会因选用的抗白细胞和血小板特异抗体种类的不同而不同。此处选择CD14是因为这此蛋白在白细胞与血小板粘附中并不发挥作用。白细胞特异性抗体是否对LPA的形成产生影响可通过对比通过FS/SS设门所得出的LPA值与通过白细胞抗体设门得出LPA值来获知。单核细胞的异质性比较大（纯度较低），但可通过其表面的抗原来去除这些影响。血小板特异性抗体也会影响LPA的形成。比如不应使用直接针对Mac-1 (CD11b/18)与CD42b的结合区域的抗体，因为这个反应在保持LPA稳定中有十分重要的作用。针对P选择素的封闭抗体（CD62P）或它的受体PSGL-1（CD162）可十分有效地阻断LP

19、A的形成，从而用它可制备样本的阴性对照。这些封闭剂不会降解已存在的LPA，所以用它们处理过的样本并不能真正认为是阴性对照。而使用封闭剂后LPA所形成显著差异可用于评估所选择的白细胞或血小板抗体的活化作用。在备选方案中介绍的预先固定方法处理的样本受抗体的影响较小，但样本经固定洗涤步骤后也会影响LPA的检测。固定步骤会减少或限制某些抗体与抗原的结合。作为一个普遍现象，抗血小板抗体，特别是染色血小板强阳性的，会显著引起LPA数量的上升。这个现象在几乎没有LPA的阴性对照样本中特别明显。预固定方法要求将固定剂洗脱并重新聚集样本供染色使用。在洗涤步骤中特别要注意固定的CD62P阳性的血小板可能会与白细胞

20、粘附。在备选方案中的低离心力洗涤步骤中会抛弃绝大部分的单个血小板，所以以上的可能性在此方法中被最小化了。单核细胞在采集过程中属时间限制类型细胞；在2到7分钟内需要采集1000到2000个单核细胞颗粒。样本流速要控制在低速至中速，要视样本稀释度而定。当试图要增加样本浓度或流速时，白细胞-血小板复合物（特别是单核细胞-血小板颗粒）会因为未洗样本中存在大量血小板而非特异性问题。为了了解血小板与白细胞同时经过检测区对增加性白细胞-血小板颗粒的影响，在设定流式细胞仪高速、中速和低速的条件下同时检测1000个单核细胞。通常在阴性对照样本（未加刺激剂）中，以高速检测样本时血小板颗粒阳性的单核细胞数量明显增加。在某些情况下，需要使用低速来分析样本，特别是在样本中血小板计数异常高时；在本方法中全血经过了稀释(1:44)，故中速分析对绝大部分样本都适用。流速处于中速和低速的鞘液压力将最终决定绝对样本流速，且不同仪器之间样本流的直径也不同。因此每个实验室都要单独摸索适合自己仪器的样本流速。尽管染色后的LPA经固定后十分稳定并可在4°C条件下存储72小时，但样本在固定后最好立即分析。结果解释LP