瘦素受体在实验性多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及其意义(一)

1、瘦素受体在实验性多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及其意义一【摘要】目的研究来曲唑诱导建立多囊卵巢综合征 PCOS动物模型中卵巢组织瘦素受体.及其mRNA的表达，探讨卵巢变化与PCOS发病机制的关系。方法 6周龄清洁级雌性SD大鼠45只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各15只。正常组每日自由摄取食物和水；溶剂组每日给予1 %羟甲基纤维素水溶液2mL/kg灌胃；来曲唑组以来曲唑0.5mg/kg灌胃。观察大鼠体质量、动情周期、卵巢质量及其形态学改变，测定血清黄体生 成素LH、睾酮T、胰岛素INS、瘦素LEP及血糖FG水平，采用免疫组织化学 和Ob R及其mRNA达并对 3组的各指标进行比拟。结果来曲唑

2、组大鼠体质量和卵巢质量指数升高，动情周期消失，卵巢体积增大，白膜增厚，H E染色可见较多囊状扩张的卵泡且黄体数量明显下降，血清T LH、INS、LEP水平明显升高P0.05;卵巢及其mRNA表达明显增强P0.05。结论来曲唑诱导建立的PCOS动物模型临床表现与人类似；卵巢中表达上调，可能是导致 PCOS患者不排卵、生育力下降的原因之一。【关键词】多囊卵巢综合征；卵巢；瘦素；受体，肽；疾病模型，动物多囊卵巢综合征polycysticovarysyndrome , PCOS是生育年龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病， 以卵巢的功能紊乱为特征， 常表现为不孕和肥胖，但其发病原因目前尚无定论。瘦素lepti

3、n ,LEF是肥胖基因ob基因的表达产物，近年来的研究认为丄EP是营养与生殖之间的代谢信号，它在生殖方面有许多重要的调节作用。研究还显示，LEP存在于卵泡液中，且LEP受体在人卵巢中几种不同的细胞上也有表达，说明LEP能够对性腺行使直接的作用3。笔者通过研究PCOS大鼠卵巢中及其mRNA的表达情况，探讨其与 PCOS发病机制的关系，现报告如下。1材料和方法1.1PCOS动物模型6周龄清洁级雌性 SD大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心许可证号： SCXX沪，平均体质量180g,二级动物房饲养，恒温 22C，光照12h、黑暗12h交替，自由摄取食物和水。每日定时作阴道涂片检查，选择动情周期45d

4、,连续2个正常动情周期的大鼠即开始用于实验，共选出45只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各15只。来曲唑组每日给予溶解在1 %羟甲基纤维素水溶液CMC 2mL/kg的来曲唑芙瑞，江苏恒瑞医药股份0.5mg/kg灌胃，连续；正常组每日自由摄取食物和水；溶剂组每日给予 CMC2mL/kg灌胃。1.2大鼠体质量及动情周期每日同一时间称量大鼠体质量，同时进行阴道脱落细胞涂片，瑞 氏染色后显微镜下观察细胞形态的变化，确定大鼠动情周期的情况。1.3大鼠血清中各项指标末次给来曲唑24h后，禁食8h，对所有大鼠进行下腔静脉取血，采用放射免疫分析法测定大鼠血清黄体生成素LH、睾酮T及胰岛素INS、LEP试剂盒购

5、自天津市协和医药科技，批内和批间变异系数分别10%和15%。血糖FG测定采用葡萄糖氧化酶法，计算胰岛素敏感指数：Homa IR=F6xFINS/22,51.4卵巢标本采集及处理腹腔注射水合氯醛0.3mL/100mg 麻醉，翻开腹腔，用去 RNA酶处理过的机械取出双侧卵巢，去除外表脂肪组织并称质量，一侧用10%中性福尔马林固定后 石蜡包埋，留作光镜下染色观察卵巢形态学改变和免疫组织化学实验；另一侧存于-80 C冰箱，留作 PCR检测。1.5卵巢中Ob R表达常规石蜡包埋，连续冠状切片，厚4艸，共3套，分别用于H E染色、免疫组织化学染色及其对照试验。按Elivision免疫组织化学方法进行操作，

6、一抗为羊抗兔LEP受体抗体1 : 100 北京中杉金桥生物技术，25C过午；二抗50 L为羊抗兔福州迈新生物技术开发30min , DAB显色35min，苏木素复染1min。结果判定参照文献 6,阳性为细胞内出现黄色颗粒。按染色强度与阳性细胞百分数判定，50%细胞着棕黄色为强阳性，评3分；50%细胞着棕黄色或50%着黄色为阳性，评 2分；50%细胞着黄色或均着淡黄色为弱阳性，评1分；不着色为阴性，评0分。每个标本观察8个视野，双盲法评估结果。1.6卵巢中 的表达总RNA提取每100mg组织加1.0mL的Trizol溶液，充分研磨组织后，室温静置5min。加0.2mL氯仿用力振荡 15s，室温静

7、置 5min。 4 C, 12000r/min 离心15min。吸上清，参加 等体积约0.5mL的异丙醇，混匀后室温静置10min , 12000r/min离心10min。弃上清，留取沉淀。加1mL现配的75%的乙醇预冷振荡洗涤RNA沉淀1次，12000r/min离心5min。 弃上清，加20 L的焦碳酸二乙酯DEPC水溶解RNA。1.6.2RealTimeRT PCR 采用 Takara公司 SYBRPrimeScriptRT PCRKit PerfectRealTime，引物 由上海生工生物工程技术合成：:F:R：170bp:F:r： 5 accctcatagATG CACAG 3产物鉴定取5卩LPC产物加1 uL上样缓冲液加样，于2 %琼脂糖凝胶上进行电泳， 以50 500bpDNAIadder作为Marker。电泳电压125V，凝胶图像分析仪DelDoc1000 ,美国腕 RAD 公司分析并摄像，观察 PCR扩增结果。实时定量PCR结果采用比拟阈值法测定目的基因的相对表达7:目的基因的相对表达量= 2丄 Ct, Ct= Ct,目的基因 Ct,内参基因实验组 Ct, 目的基因 Ct,