罗氏诊断二代测序技术在HBV耐药检测中的应用

1、罗氏诊断二代测序技术罗氏诊断二代测序技术在在HBVHBV耐药检测耐药检测中的中的应应用用 罗氏诊断罗氏诊断 应用科学应用科学市场部市场部 刘璐璐刘璐璐HBV HBV 耐药性产生耐药性产生 病毒每天高速复制，并在复制时发生错误，这些自发突变导致突变株出现。 突变株增殖能力通常低于野生型，因而在未用药的群体中占少数。 但在病毒药物作用下，药物对于耐药性的突变有选择作用，导致了耐药菌株成为优势株，导致药物治疗的失败。 耐药是核苷酸类药物的共性耐药是核苷酸类药物的共性耐药检测的意义耐药检测的意义治疗前检测，有助于临床判断用治疗前检测，有助于临床判断用药是否有效；药是否有效；治疗中每治疗中每 36个月检

2、测，有助于个月检测，有助于观察疗效，及时调整用药观察疗效，及时调整用药EASL Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol, 2009, 50: 227-242.用药后出现耐药用药后出现耐药拉米夫定拉米夫定 阿德福韦酯阿德福韦酯 恩替卡韦恩替卡韦 替比夫定替比夫定 替诺福韦替诺福韦测序用于病毒耐药检测测序用于病毒耐药检测深度测序可检出低频准种深度测序可检出低频准种超深焦磷酸测序可检测低于1%的准

3、种普通焦磷酸测序仅限5%及以上的准种毛细管电泳测序仅限20%及以上的准种提早判断准种组成，在劣势菌种未发展成为优势菌种之前，即调整用药策略；降低治疗失败可能性，减少对身体伤害。454454高深度测序优势高深度测序优势已经成功实现对于RTRT基因区段基因区段1%1%突变位点的发现突变位点的发现，比目前常用的一代测序及线性探针反向杂交法更加灵敏更加灵敏进行相对定量定量，对于病毒群体中突变数量改变进行跟踪深度测序的运用将较传统方法提前提前3-63-6个月检测出突变个月检测出突变，因此能够更好的抓住治疗的时机并给出治疗的方案454454测序系统发展测序系统发展测序通量及读长不断增加，大小测序平台齐备

4、GS 20 GS 20 GS FLX Standard GS FLX Standard20 Mb20 Mb100 Mb100 Mb200520052007200720082008FutureFutureEven Longer ReadsEven Longer ReadsHigher DensityHigher DensityLaterLater GS FLX Titanium GS FLX Titanium500 Mb500 MbGS Junior TitaniumGS Junior Titanium GS GS FLX+FLX+20112011独立独立实验室适用型实验室适用型精巧精巧型型 二

5、代测序平台二代测序平台 GS JuniorGS JuniorGS Junior GS Junior 测序步骤概览测序步骤概览Mix ssDNA & capture beads 454 454 测序流程测序流程 文库构建文库构建1. 4541. 454文库构建：文库构建：Shotgun Shotgun Paired-endPaired-end300bp1Kb, 3Kb, 300bp1Kb, 3Kb, 8Kb, 20Kb8Kb, 20Kb* *PCRPCR产物可直接测序产物可直接测序传统文库构建：传统文库构建：BACBAC克隆克隆-Shotgun/PCR-Shotgun/PCR一个片段一个片段 =

6、 = 一个反应珠一个反应珠 454 454 测序流程测序流程 emPCR2. emPCR2. emPCR每个每个DNADNA分子分子独立独立进行进行PCRPCR反应后反应后独立独立测序测序扩增效果好，适应高扩增效果好，适应高GCGC含量片段、甚至含量片段、甚至FFPEFFPE样本样本一个反应珠一个反应珠 = 一个读长一个读长 单克隆测序的价值单克隆测序的价值通过通过 emPCRemPCR实现单克隆实现单克隆直接阅读每一种分子结果直接阅读每一种分子结果突变比例的计算（低频）基于实际的序列信息突变比例的计算（低频）基于实际的序列信息每个每个DNADNA分子分子独立独立进行进行PCRPCR反应后反应

7、后独立独立测序测序扩增效果好，适应高扩增效果好，适应高 GCGC含量片段、甚至含量片段、甚至FFPEFFPE样本样本Sanger 流程-混合测序454 流程-单克隆测序454454测序流程测序流程 测序测序1. 特异的测序引物和单链DNA模板结合, 加入一种dNTP2. DNA DNA 聚合酶聚合酶的作用下，单个 dNTP与模板的下一个碱基配对，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)3. 在ATPATP硫酸化酶硫酸化酶的作用下，PPi和APS结合形成ATP4.在荧光素酶荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，被CCD捕捉5.5. Apyrase Apyra

8、se降解剩余的dNTP和残留的少量ATP6.加入另一种dNTP重复2-5步骤7.在每一个测序循环里，碱基以同样的次序(TACG)流过PicoTiterPlatePicoTiterPlate板8.当模板链的互补核苷酸加入延伸链时，会产生了荧光信号9.荧光信号强度与所加入的核苷酸数目成比例10. 荧光信号被CCD照相机记录荧光素酶荧光素酶ATP ATP 硫酸化酶硫酸化酶氧化荧光素氧化荧光素可见光可见光3. 3. 基于焦磷酸反应的基于焦磷酸反应的边合成边边合成边测序测序13Sequencing By Synthesis A A T C G G C A T G C T A A A A G T C AC

9、TARepeated dNTP flow sequence:GGTCAG TCA G TTTTCAGGATCCCGATTGCTAAnneal PrimerProcess continues until user-defined number of nucleotide flow cycles are completed.边合成边测序边合成边测序 实验体系的不断优化使得当前可获得实验体系的不断优化使得当前可获得Junior Junior 平均为平均为400bp400bp的读长的读长并将继续以提升读长为技术的发展方向之一并将继续以提升读长为技术的发展方向之一454454测序流程测序流程 数据获取数

10、据获取图像处理图像处理信号处理信号处理454454测序测序流程流程数据分析数据分析测序与分析同时进行，10小时完成10小时产出 10万条以上的序列自带4套软件，满足多数应用需求软件自动过滤，高质量序列比例高400bp 的位置仍可保持Q20的准确性GS JuniorGS Junior在德国大肠杆菌事件中在德国大肠杆菌事件中Nicholas J Loman et al., Performance comparison of Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platformsbenchtop high-thr

11、oughput sequencing platforms, Nature Biotechnology, 2012 DOI: 10.1038/nbt.2198454 GS Junior拥有最长的读长，平均读长在522个碱基，99%的序列可以用于基因组拼接6月3日收到样本，6月5日完成全部测序与机制确认工作数据分析仅由HPA的非专业生信团队，不到半天时间即得到结果序列读长分布图序列读长分布图 Junior 测序系统运行产生的读长范围为50-600bp，甚至更长 shot gun实验将利用几乎全部数据 平均读长平均读长为400bp 典型读长典型读长在 450-550bp范围 Amplion 实验将主

12、要根据典型读长进行PCR引物设计Number of readsReadlength (bases)Simple Simple simplesimpleCGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCTComplex Complex 454 long reads454 long readsShort read technologyShort read technology? ? ? ? ? ?454 454 长测序能够带来什么长测序能够带来什么emPCR emPCR 保证样本的获得，长焦磷酸确保阅读保

13、证样本的获得，长焦磷酸确保阅读长读长的价值长读长的价值 一条reads通读一个目标序列，无需拼接，避免错误产生与时间消耗 通过一条reads判断突变的连锁关系 更少引物获得更多目标 引物设计的区间更灵活Junior1条reads 既可通读HBV耐药相关基因的PCR产物HBVHBV耐药耐药RTRT基因基因(1032nt)(1032nt)检测有检测有overlapoverlap的的4 4个片段个片段Fragment1Fragment1(372 nt)(372 nt)9 9Fragment2(401 nt)9Fragment3(396nt)9Fragment4(314 nt)9The Journal

14、 of Infectious Disease, The Journal of Infectious Disease, May 2009; 199(9): 1275-85. PCRPCR扩增子文库的设计扩增子文库的设计长读长给予更多引物设计空间，长读长给予更多引物设计空间，1 1条条readsreads通读热点突变区域通读热点突变区域454 B B-primer (19 bp)Locus specific PCR amplificationemPCR & 双向测序Target specific sequence (ca. 25 bp)454 A A-primer (19 bp)A AB BSeq

15、uence of interest200 400 bp200 400 bp通过MID序列，可以混合多个样本测序同时测序Data analysisRT基因可设计3个PCR产物片段S基因可设计2个PCR产物片段C基因可设计1个PCR产物片段X基因可设计1个PCR产物片段Pre-C基因可设计1个PCR产物片段454454测序在测序在HBV HBV 耐药基因耐药基因测序测序的的应用方案应用方案Day1 DNA 提取Day1 PCR产物的获取Day1 PCR产物纯化Day1 PCR产物样品定量(Agilent2100, qPCR仪)Day1 PCR产物样品均一化Day1 PCR产物混样 Day1 454

16、测序建库加接头(10min)Day2 emPCR扩增(2h手工操作+6h机器运行)Day3 454 Junior测序(10h)Day4 数据分析454 454 测序测序步骤步骤HBV耐药检测应用 emPCR(乳滴PCR)扩增 每一带有MID与测序引物的HBV耐药突变高发DNA片段在其各自的微乳滴中进行独立扩增，排除了其它竞争性或污染性序列对 PCR反应的影响。 焦磷酸测序 将所有结合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中进行测序。PTP板的孔径恰好仅能容纳一颗磁珠。 将PTP板置于GS测序仪中，单个核苷酸依次流经孔洞和DNA捕获磁珠间。当所加入的核苷酸与模板互补时，便

17、产生化学发光信号，进而被GS系统的CCD相机记录。454454的分析结果呈现的分析结果呈现可检测单点突变454454的分析结果呈现的分析结果呈现可关注已知突变Multiple Mutations in a Codon Associated with Multiple Mutations in a Codon Associated with NRTI ResistanceNRTI ResistanceT69ConfidentialMultiple Mutations in a Codon Associated with Multiple Mutations in a Codon Associat

18、ed with NRTI ResistanceNRTI ResistanceThr69 35% Alanine, 42% Asparagine, and 1.2% SerineConfidential454454的分析结果呈现的分析结果呈现可检测有意义的连锁突变位点已有已有RTRT基因突变数据库基因突变数据库Standford HBVSeqStandford HBVSStandford HBVSeqStandford HBVSeq结果展示结果展示近两年使用近两年使用454 454 发表发表HBVHBV耐药检测文献耐药检测文献Analysis of hepatitis B virus drug-

19、resistant mutant haplotypes by ultra-deep Analysis of hepatitis B virus drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep pyrosequencing. pyrosequencing. Ko SY, Oh HB, Park CW, Lee HC, Lee JE. (2012) Clin Microbiol Infect ePub:Ultra-deep pyrosequencing detects conserved genomic sites and quantifies lin

20、kage of Ultra-deep pyrosequencing detects conserved genomic sites and quantifies linkage of drug-resistant drug-resistant amino Acid amino Acid changes in the hepatitis B virus changes in the hepatitis B virus genome. genome. Rodriguez-Fras F, Tabernero D, Quer J, Esteban JI, Ortega I, Domingo E, Cu

21、bero M, Cams S, Ferrer-Costa C, Snchez A, Jard R, Schaper M, Homs M, Garcia-Cehic D, Guardia J, Esteban R, Buti M. (2012) PLoS One 7(5):e37874.Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencing in a chronic Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencing in a chronic hepatitis B hepatitis B virus (HBVvirus (HBV)-infected patient exposed to several unsuccessful therapy )-infected patient exposed to several unsuccessful therapy schemes. schemes. Sede M, Ojeda D, Cassino L, Westergaard G, Vazquez M,