淋巴细胞亚群检测方案

1、目和相对比例都在一定的范围内。那么临床常见的淋巴细胞亚群包括哪些项目?一、淋巴细胞亚群二、抗体组合方案联合CD45的三色方案主要是有四种不同的试剂。1.CD45/CD3/CD4这个抗体组合主要用来检测T3细胞和T4细胞。2.CD45/CD3/CD8用来检测T3细胞和T8细胞。3.CD45/CD3/CD19用来检测T3细胞和B细胞。4.CD45/CD3/CD16和/或CD56用来检测T3细胞和NK细胞。(三双色方案如果实验室在边远的地区,条件不足,只能做双色方案,但是在双色方案中建议要把CD3加进来,因为CD45能很好地将白细胞和其他的干扰细胞,尤其是红细胞进行区分。如果不能用CD45,最好能用

2、到CD3,CD3可以特异的标记T淋巴细胞,T淋巴细胞和CD4做双标可以克服单一的CD4抗体。为此,双色方案中也分为四管,每管当中建议都包含有CD3。1.CD3/CD4用来检测T3细胞和T4细胞。2.CD3/CD8用来检测T3细胞和T8细胞。3.CD3/CD19用来检测T3细胞和B细胞。4.CD3/CD16和/或CD56用来检测T3细胞和NK细胞。尽管检测条件不允许做四色或三色的分析,但也至少要用CD3和其他的直标抗体进行双免疫荧光染色方案,不建议采用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。(四7-氨基放线菌素D(7-AAD联合CD45方案1.目的对于超过24小时的标本或肉眼观察发现已经变质的标本,需使用

3、7-氨基放线菌素D(7-AAD结合CD45(评估淋巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡复染评估细胞活力。2.判定7-AAD荧光染料主要染活细胞,主要用来鉴定细胞活性。(17-AAD阴性者是活细胞群。(27-AAD阳性者为细胞膜不完整的死细胞群。(37-AAD阴性细胞群阴性细胞群计数为75%时为最低细胞活力。(4对于细胞活力低于75%的标本,建议采用7-AAD结合CD45的方案,包括的组合方案。三、数据采集和分析(一联合CD45和SSC设门确定淋巴细胞群方案1和方案2都存在CD45,首先建议采用联合CD45和侧向散射光SSC设门来确定淋巴细胞群。它是准确分析淋巴细胞亚群的第一步,可以用于来定位淋巴细胞群

4、,把淋巴细胞群找到,排除标本中非淋巴细胞或细胞碎片的干扰。首先在CD45/SSC散点图中,调整SSC,使所有白细胞群均可见。第二步是根据CD45强阳性细胞群设门或者划定区域。因为在CD45染色细胞中,淋巴细胞群呈现CD45强阳性和SSC弱表达。设门时尽可能包括所有淋巴细胞,仪器会给一个提示,一共是包括了多少淋巴细胞数。一般门内淋巴细胞数不低于95%,而且要排除单核细胞和嗜碱细胞的感染,因为单核和嗜碱在周围,很容易对淋巴细胞进行干扰。单核细胞的CD45呈弱表达,而SSC呈中等强度表达。嗜碱性粒细胞的CD45和SSC均为低表达。如果不能确定标记的淋巴细胞群是否被设门设的比较准确,里面是否含有其他细

5、胞的干扰,还有一个办法就是将CD3/SSC、CD19/SSC以及 CD56或CD(16+56/SSC中T细胞、B细胞和NK细胞的分布特征筛选出来,并在CD45/SSC双参数散点图中显示,以监测设门的准确性。当设门准确了,准确的找到淋巴细胞后,才能采集细胞数。第三步,采集细胞数。非设门荧光散点图中,每一荧光通道至少收集5000个淋巴细胞,以确保对数量较少的淋巴细胞亚群(如占总淋巴细胞数的10%提供足够量的细胞。 从上面的图片上可以看到,图形中画黑框、标记是紫色的细胞是淋巴细胞群,在它的上方是单核细胞,用红颜色标记,嗜碱性细胞CD45和SSC的表达较低,用粉颜色标记的。(二淋巴细胞亚群分析和相对计

6、数首先在亚群分析时设置几个散点图:CD3/CD4散点图、CD3/CD8散点图、CD3/CD19散点图、CD3/CD56或CD(16+56散点图。散点图设置完后,在每一个荧光散点图中再设一个四象限门,将CD45/SSC散点图中选定的淋巴细胞群中的表达该抗原的阴性细胞群和阳性细胞群区分开来。 第三步,进行淋巴细胞亚群计数。T4细胞的计数,一般先得到一 个相对计数,也称为百分比,比如CD3/CD4散点图中CD3+CD4+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比,这叫做T4细胞的相对计数百分率。它占的是前一个散点图,在第一次设门的散定图中淋巴细胞的百分率。T8细胞相对计数是CD3/CD8

7、散点图中CD3+CD8+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。B淋巴细胞计数是CD3/CD19散点图中CD3-CD19+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。NK细胞相对计数是为CD3/CD56或CD(16+56散点图中CD3-CD56+细胞群或CD3-CD(16+56 +占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。T3细胞的百分率在四个散点图中都可以计数,因为每一个散点图中都含有CD3的标记。在CD3/CD4散点图中,计数为CD3+CD4-单阳性细胞群百分比和CD3+CD4+双阳性细胞群百分比的总和。在CD3/CD8散点图中也一样,计数为CD3+CD

8、8-单阳性细胞群百分比和CD3+CD8+双阳性细胞群百分比的总和。在CD3/CD19散点图中,计数为CD3+CD19-细胞群百分比。在CD3/CD56或CD3/CD(16+56散点图中,计数为CD3+CD56-或CD3-CD(16+56-百分比和CD3+CD56+或CD3+CD(16+56+百分比的总和。(三淋巴细胞亚群的绝对计数根据淋巴细胞亚群相对计数结果,对于绝对计数来讲,通常有两种绝对计数的方法,一个是单平台法,一个是双平台法。单平台方法是采用了一个内部的计数,计数的微球。所有的数据都可以从流式细胞仪这一台仪器检测到,由专用软件直接计算生成,具体操作可以试剂操作说明书。双平台方法,白细胞

9、计数需要与亚群分析使用同一标本进行测试,并在6个小时内完成。当白细胞计数不能准确获得时,不能用DP方法进行淋巴细胞绝对计数,只能采用SP方法。不能采用淋巴细胞计数来计算淋巴细胞亚群绝对计数。因为淋巴细胞计数在血细胞分析仪上表现出更大变异度,白细胞计数作为分母比淋巴细胞计数更为稳定。(四数据分析可靠性的验证1. CD45在有些验证中要采用CD45,CD45在三色和四色抗体组合方案的每一标本管中均存在,这样它既可以对淋巴细胞群进行设门,因为它在每一管中都存在,也可以根据CD45表达情况和图形分布情况检测和评估样本管间的变异,所以这是一个很好的一个验证方法。重复结果间的差异如果大于( 说明样本管间的

10、变异较大四、对照对于淋巴细胞亚群来讲，同型对照是不需要的，因为CD3、CD4和CD8的阳性细胞群和阴性细胞群都是 独立成群，很容易区分，所以同型对照的意义不大。 （二）阳性对照 需要阳性对照，分为针对方法学的阳性对照，以及针对试剂的阳性对照。 1.针对方法学的阳性对照 （1）目的 主要是监测流式细胞仪上机分析前的环节是否出现问题，包括裂解是不是完全、是不是染色效果很 差。当由于红细胞裂解不完全或染色较差时，包括阳性对照在内的所有的标本结果都会出现偏差，所以这 时阳性对照如果不好，就提示上机前的染色环节出现问题。 （2）种类 阳性对照可以用全血标本来做，也可以用商品化荧光微球试剂。 （3）使用频

11、率 每次上机前都需要做阳性对照。 2.评价试剂的阳性对照 （1） 目的 检测新批号试剂和当前批号试剂的染色效率是否出现问题，当怀疑试剂出现问题时，采用该试剂与已 知可接受性能批号的试剂同时操作进行验证。 （2）种类 阳性对照可以是全血标本，也可以是冻干淋巴细胞。 （3）使用频率 一般是在更换试剂前后来做。 所谓“补偿”就是除去某一荧光素误入到其它荧光通道中的发射光信号， 那么为什么需要进行调整荧光补偿？ 五、调整荧光补偿 （一）目的 对于淋巴细胞亚群分析至少要采用双色方案，最好采用四色方案，所以荧光补偿是非常重要的，表达 一个检测结果是否有准确，完全受到的干扰是荧光补偿，是一个重要的因素。当光

12、学检测通道的电压及增 益发生变动，当仪器维修保养后，都要对补偿进行验证或重新调整。 （二）方法 6 调整的方式有手工的方式，还有软件自动补偿方式。 （三）补偿试剂的选择 1.一般选择与最强荧光信号相匹配的补偿试剂。 2. 三色抗体组合分析 三色抗体组合分析时要通过含有荧光微球或细胞补偿颗粒的4个单标记样本管来调整补偿。第一管是 无直标抗体标本管，只有标本没有抗体。第二管是仅含有FITC直标抗体的阳性标本管。第三管是仅含PE直 标抗体的阳性标本管。第四管是仅含第三种直标抗体的阳性标本管。 3.四色抗体组合分析 可以在三色抗体组合的基础上再加上一管，也就是第五个管子，第五管是仅含有第四种直标抗体阳

13、性 标本管。 （四）荧光补偿顺序 1.三色组合方案 依次是FITC、PE和第三种荧光。先做FITC，然后PE，再做第三种荧光。补偿达到一个理想状态是将不 应该是两种荧光抗体双阳性的细胞群调整到相应的直角荧光象限中，使双阳象限中无荧光重叠。要避免过 度补偿，以防将双阳性细胞错误地识别为单阳性细胞。 2.四色组合方案 一般试剂说明书有一个很好的说明，可以按照说明书进行执行，要注意避免过度补偿。 六、结果报告和审核 （一）临床报告的内容 对于淋巴细胞亚群所出的临床报告，一般有以下几个内容：T3细胞相对计数(百分比/绝对计数(绝对 值、T4细胞相对计数(百分比/绝对计数(绝对值、T8细胞相对计数(百分

14、比/绝对计数(绝对值、B细胞 相对计数(百分比/绝对计数(绝对值、NK细胞相对计数(百分比/绝对计数(绝对值 、T4/T8比值、参考 范围、必要的解释和分析。 （二）审核内容 审核的内容包括有数据采集阈值的设定、采集细胞数和微粒数、散射光模式、抗体组合方案，与试剂 结果相关的所有设门。在发出报告之前，要把这些方面的内容都进行一个审核，审核确认无误后才能将结 果发放给临床。 七、储存 （一）采用列表模式储存标本数据 数据在储存方面也有一定的要求，要把所有的原始数据进行储存，所以一般采用的是列表模式，储存 标本数据，以确保对原始数据进行全面分析。 7 （二）采用纸质文件或电子版 储存的内容包括：每

15、个样本CD45和SSC淋巴细胞群设门图，显示淋巴细胞亚群的所有的荧光散点图的 分析结果，针对淋巴细胞亚群的室内质控图以及室间质评数据，评估检测系统性能的所有参数，包括分析 区域、分析结果，以备进行一个复核。 （三）储存期限 一般建议保留两年所有的数据。 八、质量控制 （一）室内质量控制 要求每月进行室内控制检测，对于特殊实验如艾滋病T4细胞计数建议每周进行一次。 （二）室间质量评价 推荐使用卫生部临检中心和美国病理学家协会（CAP）的室进质评。 （三）人员培训 流式细胞仪检测由于技术要求含量较高，要完成流式细胞仪厂家的基本培训，同时也要完成专业操作 培训班的定期培训。 淋巴细胞亚群最常见的有5个项目，包括T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+T细 胞和CD8+T细胞。这5个项目具有明确的临床意义，也是临床应用最广的检测项 目，非常适合检